ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2156465

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИКОГЕННОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ

Имя изобретателя: Иванова Л.А.; Измерова Н.И.; Позднякова Н.В.; Фролова Я.А. 
Имя патентообладателя: Научно-исследовательский институт медицины труда РАМН
Адрес для переписки: 121359, Москва, Маршала Тимошенко 21, УНЦ, патентное бюро, Евтухову А. Н.
Дата начала действия патента: 2000.02.01 

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии и внутренним болезням, и может быть использовано для диагностики сенсибилизации при заболеваниях кожи и внутренних органов. Берут 2 конусообразные пробирки, в каждую вносят по 0,1 мл 0,1%-ного водного раствора нитросинего тетразолия, осуществляют забор крови из пальца и вносят в указанные пробирки по 0,1 мл крови с добавлением антикоагулянта, в первую пробирку вносят 0,3 мл 0,1%-ного раствора грибкового антигена, а во вторую пробирку добавляют 0,3 мл физраствора, и данную пробирку используют в качестве контрольной, обе пробирки инкубируют при 37°С в течение 30 мин, а затем охлаждают до нормальной комнатной температуры, и обе пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, после чего из верхнего или среднего слоев суспензии клеток, как первой, так и второй пробирок готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом 10 мин, докрашивают мазки из первой и из второй пробирок 1%-ным раствором сафранина в течение 5 мин, рассматривают и оценивают окрашенные нейтрофильные лейкоциты, содержащие в цитоплазме темно-синие гранулы формазана, считают НТС - положительные нейтрофилы, и в случае превышения от 5 до 10% в мазках из первой пробирки в сравнении с мазками из второй делают вывод о наличии слабо выраженной, в случае от 10 до 20% - умеренно выраженной и при превышении от 20% и более - сильно выраженной микогенной сенсибилизации. Способ обеспечивает повышение достоверности диагностики.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и к внутренним болезням, и может быть использовано для диагностики сенсибилизации при заболеваниях кожи и внутренних органов.

Суть изобретения в том, что берут 2 конусообразные пробирки, в каждую вносят по 0,1 мл 0,1%-ного водного раствора нитросинего тетразолия, осуществляют забор крови из пальца и вносят в указанные пробирки по 0,1 мл крови с добавлением антикоагулянта; в первую пробирку вносят 0,3 мл 0,1%-ного раствора грибкового антигена, а во вторую пробирку добавляют 0,3 мл физраствора, и данную пробирку используют в качестве контрольной; обе пробирки инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, а затем охлаждают до нормальной комнатной температуры; и обе пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, после чего из верхнего или среднего слоев суспензии клеток, как первой, так и второй пробирок готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом 10 мин; докрашивают мазки из первой и из второй пробирок 1%-ным раствором сафранина в течение 5 мин; рассматривают и оценивают окрашенные нейтрофильные лейкоциты, содержащие в цитоплазме темно-синие гранулы формазана, считают НТС - положительные нейтрофилы, и в случае превышения от 5 до 10% в мазках из первой пробирки в сравнении с мазками из второй делают вывод о наличии слабо выраженной, в случае от 10 до 20% - умеренно выраженной и при превышении от 20% и более - сильно выраженной микогенной сенсибилизации.

Известны способы диагностики in vitro микогенной сенсибилизации [1,2] по уровню определения антител к грибковому антигену.

Им присущи следующие недостатки. Высокая травматичность, так как кровь берут из вены и в большом количестве. Низкая информативность, так как аллергическая реакция на грибок редко протекает по немедленному типу в системе гуморального иммунитета. Степень выраженности уровня сенсибилизации не выявляется.

В качестве прототипа выбран способ диагностики [3] сенсибилизации. Ему и присущи следующие недостатки. Метод травматичен. Не имеется достаточного количества градаций для диагностики уровня сенсибилизации.

В предложенном изобретении решены следующие задачи: снижена травматичность забора материала для исследования; повышена достоверность диагностики и частота корреляции с кожными пробами, с грибковым антигеном и выраженностью наблюдаемой клинической картины; увеличена точность трех градаций степени выраженности уровня сенсибилизации in vitro.

Указанная задача решена тем, что берут 2 конусообразные пробирки, в каждую вносят по 0,1 мл 0,1%-ного раствора нитросинего тетразолия, осуществляют забор крови из пальца и вносят в указанные пробирки по 0,1 мл крови с добавлением антикоагулянта; в первую пробирку вносят 0,3 мл 0,1%-ного раствора грибкового антигена, а во вторую пробирку добавляют 0,3 мл физраствора и данную пробирку используют в качестве контрольной; обе пробирки инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, а затем охлаждают до нормальной комнатной температуры; и обе пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, после чего из верхнего или среднего слоев суспензии клеток как первой, так и второй пробирок готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом 10 мин, докрашивают мазки из первой и из второй пробирок 1%-ным раствором сафранина в течение 5 мин; рассматривают и оценивают окрашенные нейтрофильные лейкоциты, содержащие в цитоплазме темно-синие гранулы формазана, считают НТС - положительные нейтрофилы, и в случае превышения от 5 до 10% в мазках из первой пробирки в сравнении с мазками из второй делают вывод о наличии слабо выраженной, в случае от 10 до 20% - умеренно выраженной и при превышении от 20% и более - сильно выраженной микогенной сенсибилизации. Способ выполняют в следующей последовательности. Берут 2 конусообразные пробирки, в каждую вносят по 0,1 мл 0,1%-ного водного раствора нитросинего тетразолия. Если меньше 0,1% тетразолия, то не во всех клетках крови пройдет реакция; если больше 0,1% тетразолия, то часть красителя выпадает в осадок на стекле и существенно снизится и не будет обнаружено достаточного количества градаций для оценки уровня сенсибилизации.

Осуществляют забор крови из пальца в объеме 0,3 мл. Данный объем не превышают, так как для дальнейшего анализа требуется меньшее количество крови.

Вносят в указанные 2 пробирки по 0,1 мл крови с добавлением антикоагулянта. Значение 0,1 мл крови оптимально для реакции смешивания с ранее введенным в пробирки в качестве реагента и в объеме и 0,1 мл нитросинего тетразолия.

В первую пробирку вносят 0,3 мл 0,1%-ного грибкового антигена. Объем 0,3 мл оптимален для смешивания с предыдущими ингредиентами. Если концентрация грибкового антигена меньше 0,1%, то затруднено проявление цитохимического эффекта. Если концентрация указанного антигена больше 0,1%, то в реакции с нитросиним тетразолием подавляется биохимическая активность клетки.

Во вторую пробирку добавляют 0,3 мл стандартного физраствора. Данную пробирку в дальнейшем используют как контрольную.

Обе пробирки инкубируют при 37^oC в течение 30 мин. Проведение инкубации за время менее 30 мин не обеспечивает выявление реакции в клетках. Время более 30 мин не улучшает показателей реакции, но приводит к некоторой повреждаемости клеток.

По истечении 30 мин инкубации обе пробирки охлаждают до нормальной комнатной температуры.

Центрифугируют две указанные пробирки при частоте вращения 1000 об/мин в течение 5 мин.

Если скорость вращения меньше 1000 об/мин, то наблюдается недостаточное разделение на фракции.

При скорости вращения более 1000 об/мин может наблюдаться травматизация клеток. Время центрифугирования менее 5 мин приводит к недостаточному разделению клеток. Если центрифугировать более 5 мин, то повреждаются клетки субстрата.

Из верхнего или среднего слоев суспензий, полученных в первой и во второй пробирке, готовят мазки. Данные мазки, сделанные из среднего слоя, дополняют объем исследуемого материала. Мазки, приготовленные из верхнего слоя, служат основным диагностическим материалом. Данные мазки фиксируют метиловым спиртом 10 мин. Если время фиксации меньше 10 мин, то не будет сохранена структура клеток. Длительность фиксации более 10 мин приводит к ингибиции биохимических свободно радикальных процессов в клетках.

Докрашивают мазки из первой и второй пробирок 1%-ным раствором сафранина в течение 5 мин. Если окрашивать менее 5 мин, то остаются непрокрашенными отдельные структуры клеток. Время окраски более 5 мин приводит к перекрашиванию мазка.

Считают НСТ-положительные нейтрофилы, то есть содержащие окрашенные гранулы формазана.

В случае превышения содержания НСТ-положительных нейтрофилов от 5 до 10% в мазках из первой пробирки в сравнении с мазками из второй, делают вывод о наличии слабо выраженной сенсибилизации. В случае превышения от 10 до 20% и в мазках из второй пробирки в сравнении с первой делают вывод об умерено выраженной сенсибилизации. В случае превышения числа нейтрофилов на 20% и более находят сильно выраженную микогенную сенсибилизацию.

Пример 1. Больная С. ,45 лет. Процесс локализуется в складках между 4 и 3, 4 и 5 пальцами стоп, характеризуется незначительными эритематозно-шелушащимися очагами, сопровождающимися слабым зудом. Проводят иммуно-цитохимическое исследование для выявления микогенной сенсибилизации. Для этого берут 2 конусообразные пробирки, в каждую вносят по 0,1 мл 0,1%-ного водного раствора нитросинего тетразолия, осуществляют забор крови из пальца и вносят в указанные пробирки по 0,1 мл крови с добавлением антикоагулянта; в первую пробирку вносят 0,3 мл 0,1%-ного раствора грибкового антигена, а во вторую пробирку добавляют 0,3 мл физраствора и данную пробирку используют в качестве контрольной; обе пробирки инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, а затем охлаждают до нормальной комнатной температуры; и обе пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, после чего из верхнего или среднего слоев суспензии клеток, как первой, так и второй пробирок готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом 10 мин; докрашивают мазки из первой и из второй пробирок 1%-ным раствором сафранина в течение 5 мин; рассматривают и оценивают окрашенные нейтрофильные лейкоциты, содержащие в цитоплазме темно-синие гранулы формазана, НСТ-положительные нейтрофилы в мазках крови из первой и второй пробирок. В мазках из первой пробирки содержание НСТ-положительных нейтрофилов составляет 19%. В мазках из второй пробирки указанные нейтрофилы составляют 11%. Разность НСТ-положительных нейтрофилов в исследуемых на аллергическую реакцию мазках и в контроле составляет 8%. Делают вывод о наличии слабо выраженной микогенной сенсибилизации.

Пример 2. Больная Н., 35 лет. Ногтевые пластинки 5 пальца стоп желтоватого цвета, деформированы, крошатся, отмечается подногтевой гиперкератоз. На коже 4-й межпальцевой складки стоп наблюдается отечная эритема с мацерацией, микровезикуляцией, сопровождающейся ощущениями зуда и жжения. Берут 2 конусообразные пробирки, в каждую вносят по 0,1 мл 0,1%-ного водного раствора нитросинего тетразолия, осуществляют забор крови из пальца и вносят в указанные пробирки по 0,1 мл крови с добавлением антикоагулянта; в первую пробирку вносят 0,3 мл 0,1%-ного раствора грибкового антигена, а во вторую пробирку добавляют 0,3 мл физраствора и данную пробирку используют в качестве контрольной; обе пробирки инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, а затем охлаждают до нормальной комнатной температуры; и обе пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, после чего из верхнего или среднего слоев суспензии клеток, как первой, так и второй пробирок готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом 10 мин; докрашивают мазки из первой и из второй пробирок 1%-ным раствором сафранина в течение 5 мин; рассматривают и оценивают окрашенные нейтрофильные лейкоциты, содержащие в цитоплазме темно-синие гранулы формазана. Считают НСТ-положительныве нейтрофилы в мазках крови из первой и второй пробирок. В мазках из первой пробирки активность НСТ-положительных нейтрофилов составляет 29%. В мазках из второй пробирки активность 12% соответственно. Разность показателей активности составляет 17%. Диагностируют умеренно выраженную микогенную сенсибилизацию.

Пример 3. Больная М., 47 лет. Ногтевые пластинки всех пальцев стоп деформированы, утолщены, сероватой тусклой окраски. В межпальцевых складках трещинки с четким шелушением вокруг. Кожа подошв сухая, на фоне застойной эритемы отмечаются складки с муковидным шелушением. Субъективно беспокоит зуд. Больному назначено цитохимическое исследование НСТ-теста с грибковым антигеном. Берут 2 конусообразные пробирки, в каждую вносят по 0,1 мл 0,1%-ного водного раствора нитросинего тетразолия, осуществляют забор крови из пальца и вносят в указанные пробирки по 0,1 мл крови с добавлением антикоагулянта; в первую пробирку вносят 0,3 мл 0,1%-ного раствора грибкового антигена, а во вторую пробирку добавляют 0,3 мл физраствора и данную пробирку используют в качестве контрольной; обе пробирки инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, а затем охлаждают до нормальной комнатной температуры; и обе пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, после чего из верхнего или среднего слоев суспензии клеток, как первой, так и второй пробирок готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом 10 мин; докрашивают мазки из первой и из второй пробирок 1%-ным раствором сафранина в течение 5 мин; рассматривают и оценивают окрашенные нейтрофильные лейкоциты, содержащие в цитоплазме темно-синие гранулы формазана. Считают НСТ- положительные нейтрофилы мазка. Определяют в мазках из первой пробирки 41% указанных нейтрофилов; в мазках из второй - контрольной пробирки, рассчитанные данные составляют 15%. Разность числа окрашенных нейтрофилов в мазках из первой и второй пробирок составляет 26%. Диагностируют сильно выраженную микогенную сенсибилизацию. Диагноз подтвержден при микроскопическом исследовании, в котором в соскобах ногтевых пластинок был выявлен мицелий патогенного гриба.

Эффективность способа

1. Снижена травматичность забора материала для исследования. Берут всего 0,1 мл крови из пальца. Во всех существующих методах осуществляют забор крови из вены, что травматично. Возникает риск инфекционных осложнений.

2. Повышена достоверность анализа, так как проведена дифференциация степени выраженности уровня сенсибилизации по трем градациям.

3. Результаты проведения лечебных мероприятий (см.таблицу) подтверждают эффективность.

ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Кишкин П.Н. Дерматомикозы. Л. 1954.

2. Кассирский И.A. Алексеев Г.А. Клиническая гематология. М. 1970.

3. Адо А.Д. Общая аллергология. М. 1970.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ диагностики микогенной сенсибилизации путем проведения цитохимической реакции, отличающийся тем, что берут 2 конусообразные пробирки, в каждую вносят по 0,1 мл 0,1%-ного водного раствора нитросинего тетразолия, осуществляют забор крови из пальца и вносят в указанные пробирки по 0,1 мл крови с добавлением антикоагулянта, в первую пробирку вносят 0,3 мл 0,1%-ного раствора грибкового антигена, а во вторую пробирку добавляют 0,3 мл физраствора, и данную пробирку используют в качестве контрольной, обе пробирки инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, а затем охлаждают до нормальной комнатной температуры, и обе пробирки центрифугируют при 10000 об/мин в течение 5 мин, после чего из верхнего или среднего слоев суспензии клеток, как первый, так и второй пробирок, готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом 10 мин, докрашивают мазки из первой и из второй пробирок 1%-ным раствором сафранина в течение 5 мин, рассматривают и оценивают окрашенные нейтрофильные лейкоциты, содержащие в цитоплазме темно-синие гранулы формазана, считают НТС - положительные нейтрофилы, и в случае превышения от 5 до 10% в мазках из первой пробирки в сравнении с мазками из второй делают вывод о наличии слабо выраженной, в случае от 10 до 20% - умеренно выраженной и при превышении от 20% и более - сильно выраженной микогенной сенсибилизации.

Версия для печати
Дата публикации 01.04.2007гг

---

---