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invention
Fédération de Russie Patent RU2075289

PROCEDE DE PRODUCTION DE MASSE microtubercules de pommes de terre

PROCEDE DE PRODUCTION DE MASSE microtubercules de pommes de terre

Nom de l'inventeur: Hiyuk Yong [KR]; Yang Liu, Riolo [KR]; Yoo Bong-Hong [KR]; Seung-Young Gyun [KR]; Heng-Soon Lee [KR]; Yad Heung John [KR]; Yong-Suk Koo [KR]
Le nom du titulaire du brevet: la Corée Instityut Fin de-Science Technology (KR)
Adresse de correspondance:
Date de début du brevet: 07.03.1990

Utilisation: l'agriculture et la biotechnologie. RESUME DE L'INVENTION: microtubercules de reproduction de masse implique l'induction du virus sans mikroklubnegennyh germes, le traitement de basse température et la culture sur un milieu nutritif modifié, en plaçant les germes dans des récipients de culture à plat, maintenus sur un milieu solide pendant une semaine à la lumière à 30 ° C et pour la prochaine semaines dans l'obscurité à 10 ° C, puis à photopériode 6 heures avec maintien de la température de 20 o C pendant la journée et 12 ° C la nuit. Le procédé est mis en oeuvre dans les formulations de milieux de culture ci-dessus.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

La présente invention concerne un nouveau procédé pour la production en masse de plants artificiels (microtubercules de pommes de terre) exempts de germes pathogènes (notamment des virus) qui utilise la technique du tissu végétal de culture.

La pomme de terre est une espèce de plante qui appartient à la famille des solanacées et se caractérise par des tubercules de multiplication végétative. L'un des problèmes les plus graves sont généralement disponibles pour la plupart des cultures commerciales de reproduction végétative, il est de réduire le niveau causée par une infection virale, et dans le cas de dommages de pommes de terre causé par eux, est particulièrement grave (Manzer FE Merriam DC et Helper PR 1978. Am. Potato Jour. 55: 601 609. Schultz CE et Bonde R. 1944. Am patate J. 21 :. 278 283. Wright NS 1977. Am potato J. 54 :. 147 149. le programme coréen de pommes de terre de semence: l'organisation, l'impact des résultats en 1987 .. international potato Center. p. 19, 24). Par conséquent, assurer la fourniture de pommes de terre de semence sans virus joue un rôle crucial dans la résolution des techniques les rendements des cultures de pommes de terre chaque année.

Il est bien connu que la plupart de l'infection virale est causée par la plante par les pucerons qui peuvent facilement transmettre le virus par la bouche. Par conséquent, afin de produire des semences zone de production de pommes de terre sans virus, il doit être situé dans les régions montagneuses, où la population de pucerons végétaux porteurs du virus est très faible. Cependant, lorsque vous utilisez cette méthode traditionnelle du virus de la pomme de terre de la production de semences sans efficience est si faible qu'il est très difficile de produire une énorme quantité de pommes de terre de semence de bonne qualité qui est nécessaire chaque année.

Récemment, en raison de l'évolution rapide des techniques de culture de tissus végétaux rendu possible l'élevage de masse de nombreuses espèces de plantes en utilisant des techniques in vitro. Dans le cas du système de pomme de terre d'élevage des plantules sans virus rapide, en utilisant les techniques de culture en termes de croissance, bien documenté (Goodwin PB Kim YC et Adisarwanto, T. 1980. Res de pommes de terre. 23 septembre 23. Hussey G. et Stacey NJ 1981. Ann. Bot. 48: 787 796. Roset S. et Bokelmann GS 1976. Potato Res 19: 173 178) et est déjà utilisé sur une base commerciale dans une certaine mesure. Cependant, de l'efficacité de la production, le système ci-dessus présente plusieurs inconvénients graves, dont l'un réside dans le fait que la transplantation de processus in vitro du sol est un processus nécessitant un temps et du travail, qui exigent toujours une attention intensive et donc au cours de ce processus beaucoup in vitro pousses germées de pommes de terre délicates ne peuvent pas résister à des changements soudains dans l'environnement.

Depuis 1970, il existe plusieurs rapports sur la formation de microtubercules de pomme de terre in vitro, mais l'efficacité de la production était si faible que les chercheurs ont utilisé le phénomène de formation de microtubercules seulement comme un outil expérimental pour l'étude de la physiologie du tubercule de pomme de terre (Garcia-Torres L. et Gomez-Campo C. 1973. Potato . Res 16: 732 79. Abbott AJ et Belcher AR 1986. Culture Jnplant tissulaire et son application agricole wortus Butter, pp 113 122. Hussey G. et Stacey NJ 1984. Ann Bot 53: ... 565 578).

Récemment, plusieurs tentatives et reçoivent de grandes quantités de pommes de terre de semence exemptes de virus de bonne qualité en cultivant microtubercules de pommes de terre produites dans la méthode de culture in vitro en utilisant un milieu liquide (Wang PJ et HU CY 1982. Amer Potato Jour 59 :. 33 39. internationale brevet Numéro de la demande: PCT / HU 86/00053, 1986). Cependant, l'efficacité de la production de microtubercules en utilisant les méthodes ci-dessus est encore trop faible pour remplacer les pommes de terre de semence naturelles. En outre, les microtubercules qui ont été obtenus ci-dessus des méthodes dans un milieu de culture liquide, présentent plusieurs inconvénients décisifs tels que le séchage facile pendant le stockage et microtubercules fréquent vitrage, ce qui rend impropres pommes de terre artificielle. Malgré ces problèmes, microtubercules de pommes de terre qui sont formés au cours de la culture des germes de tissus de pommes de terre de la plante, peuvent apparemment être utilisés comme un moyen de remplacement de la pomme de terre points de croissance, car microtubercules de pommes de terre sont beaucoup moins délicat et sont plus faciles à manipuler dans l'étape greffe qu'avec les plants obtenus par le tissu végétal de culture. Enfin, grâce à la quantité de caractéristique de pommes de terre de semence nécessaires chaque année si grande micropropagation de pommes de terre que, même si microtubercules doit prouver son importance pratique, l'importance est réduite à zéro, sinon développer un moyen de production de masse d'un grand nombre de microtubercules à faible région et fournissent ainsi leurs agriculteurs à un prix bas, assez pour remplacer les pommes de terre de semence naturelles.

Par conséquent, dans cette invention, nous visons à développer une nouvelle méthode pour la production de masse de microtubercules de pommes de terre à un prix suffisamment bas pour leur permettre directement en tant que vrais agriculteurs substituts pour les pommes de terre de semences naturelles.

En conséquence, certains des objectifs et avantages de notre invention sont de développer une nouvelle méthode pour les tissus végétaux de culture pour la production de masse de plants artificiels (microtubercules de pommes de terre), exempt de l'agent pathogène, qui est en mesure de remplacer les pommes de terre de semence naturelles, ou pour être utilisé en remplacement des pommes de terre de semence directement précédant la production de pommes de terre de semence naturelles. En conséquence de cette invention, il est maintenant de plus en plus possible de produire en masse des pommes de terre de semence artificielle, au moins plus de 30 fois plus efficace que la méthode déjà connue pour produire des microtubercules. Ainsi, grâce à cette invention, il est possible de produire des pommes de terre de semences artificielles à un prix nettement moins cher suffisant pour fournir aux agriculteurs comme un substitut pour les plants naturels. D'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront à l'examen des figures et de la description détaillée de l'invention.

Fig. 1. Cultivating donnant les qualités microtubercules "Superior", qui germent rapidement sur des milieux de culture artificielle dans une boîte de Pétri.

Fig. 2. Pommes de terre microtubercules de qualité "supérieure", qui formaient rapidement sur des milieux de culture artificielle dans une boîte de Pétri.

Fig. 3. Potato microtubercules qualité "supérieure" qui ont été stockées dans un plat de Pétri stérile à basse température pendant une longue période de stockage.

Fig. 4. Pommes de terre juste avant la récolte, ce qui entraîne des microtubercules de germination.

Fig. 5. Le rendement moyen des pommes de terre récoltées à partir des plantes issues de microtubercules de la variété "Superior".

L'ensemble du processus de production de masse de plants artificiels de notre invention est à quelques pas. Les expériences suivantes illustrent plus en détail ce qui est réellement invention, mais cela ne signifie pas que l'invention soit limitée.

Exemple expérimental 1. La base de la méthode d'induction, l'entretien et les germes de germination masse de pomme de terre microtuberogenic sans virus.

Comme un matériau expérimental est variétés de pommes de terre exempts de virus, "Superior", qui est dérivé de la station expérimentale horticole de l'Administration du développement rural. Cela a été purifié par lavage dans l'eau du robinet, imbibé d'alcool éthylique à 70% pendant 3 minutes, stérilisés en surface avec 20 Chlorox (commercial) pendant 10 minutes, et finalement ensemencées dans des pots carrés contenant de la terre autoclavée (vermiculite, de la perlite, 1: 1) . Environ une semaine germination commence nodule qui est observée dans une chambre de croissance avec une photopériode de 16 heures à une température de culture constante (25 ° C).

Deux semaines plus tard, lorsque les germes se développent à une longueur moyenne de 5 à 10 cm, point de croissance (1 à 2 cm de longueur) sont coupés et utilisés comme matériau de base pour les points de croissance de la culture. Les tiges coupées ont été lavées avec de l'eau distillée stérile de l'eau 3 fois et trempés dans de 70 l'éthanol pendant 30 secondes, stérilisées en surface avec 10 Chlorox pendant 10 minutes, et ensemencé à la fin de la formule spécifique des milieux liquides ou solides (voir. Tableau 1, 2) pour induire et prolifération des germes, microtuberogenic.

Les conditions environnementales pour les chambres de croissance étaient identiques à ce moment-là les conditions de la germination mère du tubercule. Une semaine après le semis dans ces mêmes conditions de culture externes pousses axillaires commencent à apparaître et, dans la plupart des cas au bout de 3 semaines, ils grandissent 4 aussi vite que nécessaire pour la sous-culture. Dans le même temps appliquer des techniques de superposition de reproduction pour stimuler l'induction maximum de pousses axillaires, mais dans le cas des navires ou des tubes à essai technique nécessite beaucoup d'ingéniosité que dans cette expérience, les pousses ont été cultivées dans des boîtes de plats de Pétri (diamètre 10 cm, hauteur 1 5 cm), obtenant ainsi la reproduction in vitro automatiquement, ce qui entraîne une augmentation significative du nombre de pousses axillaires (voir. tableau 3). D'une manière générale, le taux de croissance des pousses dans un milieu de culture liquide pour la culture des taux de croissance supérieurs des pousses dans un milieu solide. Mais quand la sous-culture est resté pendant une longue période dans un milieu liquide, souvent produit germes dégénérescence ou vitrification due à l'absorption excessive d'humidité, ce qui empêche la croissance normale des pousses de pomme de terre in vitro. Par conséquent, en utilisant uniquement la phase initiale du milieu de culture liquide et ensuite utilisé un milieu nutritif essentiellement solide.

Il est à noter que le fait que pas toutes les pousses propagées sur des milieux de culture artificielle, sont capables de former des microtubercules lors du passage à l'étape suivante pour la formation de microtubercules, mais seulement tire avec des caractéristiques uniques, en d'autres termes, avec un internodes légèrement allongées avec des feuilles non-souches avec des racines fortes et pousses en particulier les reins pousses sur les extrémités (voir.. la figure 1) sont capables de former des microtubercules en grandes quantités (voir tableau 5).. Par conséquent, nous avons appelé les choux avec de telles caractéristiques spécifiques comme "germes microtubercules" et nous avons enregistré et déposé dans le coréen Type Culture Sollection sous forme de lignes de cellules végétales de propriété ( "Superior", une ligne exclusive de 8445 cellules p N). Ces germes donnant microtubercules de pommes de terre sont formées exclusivement sur les médias d'induction pour la formation de microtubercules de composition spécifique et étant une fois formés, ils conservent leurs caractéristiques même après au moins 24 années de culture unique consécutive.

Exemple expérimental 2. Un procédé de production de masse de microtubercules de pommes de terre.

Choux microtubercules sous prolifèrent illustré dans l'exemple expérimental 1 a été transféré d' abord dans une croissance des vaisseaux de haute température (30 ° C) (autres conditions de culture identiques aux médias précités prolifèrent pousses microtuberogenic) pendant une semaine et ont ensuite été transférés dans une basse température (10 o C) chambre de croissance dans l'obscurité totale pour une autre semaine. Après traitement à basse température, les plants microtubercules ont été ensemencées sur un milieu d' induction pour former des microtubercules (voir. Les tableaux 2 et 4), de la paraffine hermétiquement zaplavleny et cultivées dans une chambre de croissance où la température diurne a été maintenue à 20 ° C et une température nocturne a été maintenue à 12 ° C , tandis que la photopériode était de 6 heures de lumière et 18 heures d'obscurité. L'intensité lumineuse est d'environ 500 lux. Afin d'utiliser pleinement l'espace de la chambre de croissance, les boîtes de Pétri nous empilés autant que possible. Dans la plupart des cas, au bout de 10 jours, ils ont été transférés dans de telles conditions pour induire des microtubercules qui commencent à se former des microtubercules de pommes de terre et après 40 à 50 jours la période de culture formé microtubercules, aussi petit que le soja en une quantité de plus de 10 unités en moyenne par plat Petri. (Voir. Fig. 2).

Lorsqu'il est ajouté à l'inhibiteur de la croissance des milieux de culture de la croissance tels que phosphon D, Amo 1618, B-905 (N-diméthyl-succinique aminopoluamid acide) et de chlorure de choline Chloro (XXX) à une concentration de 50 ppm. Microtubercules l'efficacité de production est considérablement augmentée.

Dans le cas de la variété "Superior", une étude comparative par rapport à l'efficacité de la production par unité d'espace en culture d'un navire, ce qui indique la différence des résultats entre de manière traditionnelle de la culture dans un récipient contenant un milieu nutritif liquide avec des germes nemikroklubenkovyh et méthode de culture sur un support solide dans une boîte de Pétri en utilisant un germes microtuberogenic, développés dans la présente invention, y compris tous les autres traitements pour augmenter le taux d'induction de microtubercules. Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 et le Tableau 7.

Exemple expérimental 3. stockage prolongé de la pomme de terre méthode microtubercules et des procédés pour inhiber et stimuler la germination pendant le stockage.

Microtubercules de grade "Superior" obtenu quantitativement dans des boîtes de Pétri de façon aseptique, on le lave avec de l'eau distillée stérile, 3 ou 4 fois, purifiant ainsi du milieu de culture restant sur la surface. Puis ils se propagent et séchées dans une armoire propre jusqu'à ce que l'humidité est complètement éliminé de la surface. Après séchage, les microtubercules ont été mis en boîtes de Petri stériles vides, et bien fermé avec trois couches de film ciré et conservés dans un réfrigérateur à une basse température de 4 ° C (voir.. La figure 3). Après environ deux mois de vieillissement dans un reste du réfrigérateur puis germée briser facilement, laissant à la température ambiante ou pendant deux semaines ou plus, si nécessaire (voir. Tableau 8). Lorsqu'il est nécessaire de les conserver pendant une longue période sans germination, ils ont été prétraités avec une solution d'acide abscisique 5 mg / l pendant 3 heures avant stockage final à basse température. De cette façon possible d'enregistrer microtubercules dans des conditions saines pour plus d'un an, n'a pas encore confirmé qu'il avait perdu la capacité à germer ou blessé (voir. Le tableau 9). Lorsque l'on souhaite obtenir la germination rapidement après la récolte, il est possible de facilement la perturbation du processus de germination par le traitement du traitement de l' acide gibbérellique ou le long d'un bain d'eau chaude à 38 ° C à gibbérellique traitement acide (voir. Tableau 8). Ce type de gibberellinom de traitement et de haute température a été également utilisé pour réduire le temps nécessaire à la germination dans le cas de microtubercules dont la paix a rompu (voir. Le tableau 10).

Exemple expérimental 4. sortie de test variétés microtubercules de pommes de terre, "Superior".

Nous avons mené une expérience de contrôle pour comparer la culture des pommes de terre cultivées en utilisant amovibles naturelles avec des cultures cultivées avec l'aide de microtubercules de pommes de terre. Lorsque la longueur des germes de microtubercules qui germent atteint 2 à 3 mm de longueur après le traitement pour la germination comme décrit dans l'exemple expérimental 3, microtubercules ont été ensemencés directement sur le sol. Lors d'une croissance précoce des microtubercules de scène a été relativement faible par rapport à la croissance des pommes de terre amovibles naturelles, mais après l'étape intermédiaire, ils ont montré une croissance très rapide et au moment de la récolte, 3 mois après la plantation microtubercules de sol a augmenté de deux tiers plus élevés que les pommes de terre de semence naturelles . Le rendement final par plante, et montre à peu près la même proportion que le taux du sol de croissance. Plante dérivée de microtubercules produit environ 507 g de pommes de terre par plant, alors que les pommes de terre de semence naturelles d'environ 812 g par plante (voir. Tableau 11. La figure 4 et. La figure 5). En d'autres termes, le rendement moyen de microtubercules de pommes de terre a atteint environ 60 à 70% des pommes de terre de semence naturelles ont été plantés si la même manière que les pommes de terre de semence naturelle. Cependant, étant donné que les plantes issues de microtubercules étaient beaucoup plus petits que les plantes dérivées de pommes de terre de semence naturelle, il est apparemment possible pour un ajustement serré afin d'augmenter le rendement par acre.

REVENDICATIONS

1. Procédé de production de masse de microtubercules de pommes de terre, comprenant l'induction d'espèces exemptes de virus mikroklubnegennyh germes "Supfior" sur un milieu microtubercules d'induction, les germes mikroklubnegennyh traitement à basse température, et on traite la culture de germes sur un milieu d'induction mikrorostkov modifié contenant un inhibiteur de croissance supplémentaire, afin d'obtenir mikrorostkov caractérisé en ce que les germes induction de mikroklubnegennyh et recevant microtubercules sur milieu solide, contenues dans les empilés respectivement vaisseaux plats plats de Petri, incubés germes pour 1 semaine à la lumière à 30 ° C et pendant la semaine prochaine dans l'obscurité à environ 10 ° C et microtubercules obtenus par culture desdites pousses vieillies pendant 6 heures à 20 ° C et à la lumière pendant 18 heures à 12 ° C dans l'obscurité.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que mikroklubnegennye induire des pousses sur un milieu solide ayant la composition suivante en mg / l:

  • Le nitrate d'ammonium 2000
  • Le nitrate de potassium 2500
  • chlorure de calcium dihydraté 440
  • Sulfate de magnésium heptahydraté 370
  • Du phosphate de potassium 170
  • EDTA de sodium 37.25
  • Le sulfate de fer heptahydraté 27,85
  • sulfate de manganèse monohydraté 16,9
  • L'acide borique 6.2
  • Sulfate de zinc heptahydraté 8,6
  • L'iodure de potassium 0,83
  • Molybdate de sodium dihydraté 0,25
  • sulfate de cuivre pentahydraté 0,025
  • chlorure de cobalt hexahydraté 0025
  • myo-inositol 100
  • L'acide ascorbique 50
  • L'acide gibbérellique 0,1
  • riboside Zeatin 0,1
  • saccharose 20000
  • Agar 10000
  • cyanocobalamin 1.5
  • L'acide folique 0,5
  • riboflavine 0,5
  • biotine 1
  • chlorure de choline 1
  • Calcium pantothénate 1
  • sel chlorhydrate de thiamine 1
  • nicotinamide 2
  • Pyridoxine HCl 2
  • parabènes 0,5

3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les microtubercules ont produit sur un milieu solide ayant la composition suivante en mg / l:

  • Le nitrate d'ammonium 1000
  • Le nitrate de potassium 1500
  • chlorure de calcium dihydraté 440
  • Sulfate de magnésium heptahydraté 370
  • Du phosphate de potassium 500
  • Na 2 EDTA 37.25
  • Fer ferreux heptahydrate de sulfate 27,85
  • sulfate de manganèse monohydraté 16,9
  • L'acide borique 6.2
  • Sulfate de zinc heptahydraté 8,6
  • L'iodure de potassium 0,83
  • Molybdate de sodium dihydraté 0,25
  • sulfate de cuivre pentahydraté 0,025
  • chlorure de cobalt hexahydraté 0025
  • myo-inositol 100
  • riboside Zeatin 0,1
  • L'acide ascorbique 50
  • Hlorholinhlorida ou phosphon D, Amo ou 1618, ou B-905100
  • saccharose 90
  • Agar 10
  • cyanocobalamin 1.5
  • L'acide folique 0,5
  • riboflavine 0,5
  • biotine 1
  • Le chlorure de choline 1
  • Calcium pantothénate 1
  • sel chlorhydrate de thiamine 1
  • nicotinamide 2
  • Pyridoxine HCl 2
  • Parabens 0,5 °

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Date de publication 06.03.2007gg