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invention
Fédération de Russie Patent RU2037289

MÉTHODE sélectionner transformants TOMATE

MÉTHODE sélectionner transformants TOMATE

Nom de l'inventeur: Sedov Gennadiy [MD]; Chesnokov Yury V. [MD]
Le nom du titulaire du brevet: Institut de génétique de l'Académie des sciences de Moldavie (MD)
Adresse de correspondance:
Date de début du brevet: 26.06.1992

Utilisation: la biotechnologie, l'agriculture, l'élevage et les études génétiques, la culture de légumes. Les transformants inventifs ont été sélectionnés pour la culture d'embryons de tomates de la taille de 2,0 - environnement kanamitsinsoderzhaschey 2,5 mm HLH.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention se rapporte à l' agriculture, notamment pour la reproduction des plantes et peuvent être utilisés pour la sélection in vitro dans les conditions transformants dans obtenues par transformation génétique des plantes par transfert d'ADN plasmidique dans la plante par un pollen en germination zygote.

La transfection de gènes étrangers dans le génome des plantes supérieures est réalisée au niveau de la plante entière, de ses organes, de tissus spécifiques, la cellule (somatiques et générative) et protoplaste co-culture avec des techniques d'Agrobacterium ou par transfert direct d'ADN dans des cellules végétales.

méthode connue consistant à sélectionner les transformants en fonction de l'aspect résultant de la transformation des graines récessif du génotype avec les caractéristiques dominantes [1]

procédé connu, et la sélection transformante, sur la base de l'apparition de plantes ou de tumeurs morphologiquement anormales, mais aussi pour la synthèse d'acides aminés spécifiques Agrobacterium [2]

Cependant, ces procédés de criblage ne permettent pas l'utilisation des milieux sélectifs, ce qui rend le processus de sélection long et fastidieux.

Sélection de transformants méthode connue consiste en ce que les graines sont étalées sur la moitié des éléments nutritifs dilué milieu de Murashige-Skoog contenant l'agent sélectif est un antibiotique kanamycine [4]

Cependant, cette méthode ne permet pas la sélection des premiers stades de l'embryon de la plante. En outre, l'identification des transformants selon ce procédé est seulement possible lorsque développer cotylédons et la perte de la chlorophylle se produit sous l'action de la kanamycine, ce qui nécessite un temps considérable. En outre, la nécessité de semences dezinfekatsii avant de planter sur un milieu sélectif réduit la germination, ce qui affecte les transformants d'évaluation de l'efficacité et crée la possibilité d'artefacts.

OBJET DE L'INVENTION accélérer la sélection des transformants et d'améliorer l'efficacité.

Le problème est résolu comme suit: l'inoculation de l'expiant est réalisée sur un milieu contenant l'agent sélectif kanamycine, tandis que les embryons utilisés comme explants de 2,0-2,5 mm de taille, et l'ensemencement est effectué sur un milieu nutritif HLH [3]

Méthode est la suivante

fleurs de tomate pollinisées avec du pollen castré et prétraité avec un plasmide portant un gène marqueur sélectionnable pour la résistance à l'antibiotique kanamycine. Après 18-20 jours pour atteindre au moins la taille des embryons 2,0-2,5 mm, ce qui est essentiel pour leur développement de la germination et le développement normal dans des conditions in vitro, fruits larme, désinfecter, enlever les embryons et étalées sur un HLH moyen, y compris la kanamycine 200 mg / l. Après 7 jours de l'absence d'embryons transformés détectés artefacts.

Exemple. Les recherches menées sur les variétés de tomates Torch. Les fleurs sont castrés et pollinisées, comme indiqué ci-dessus. Après 20 jours, la moitié liée aux fruits de la plante larme, désinfecter, enlever 2,0-2,5 mm embryons et certains d'entre eux sont étalées sur sélective HLH des médias, qui est introduit dans la kanamycine 200 mg / l. Ces embryons avec un pourcentage de rapports de grandeur de germination indiqué dans le tableau. 1. La seconde partie des embryons sur un milieu plaqués Murashige et Skoog additionné de kanamycine. Justification du milieu de HLH est indiquée dans le tableau. 2.

Après sept jours sur la germination et le développement normal des embryons, soit l'absence de nécrose ou d'autres malformations sur HLH milieu sélectif, les transformants ont été détectés parmi eux. embryons ne se développent pas et ne poussent pas sur un milieu de sélection Murashige-Skoog.

Pour les données comparatives de la seconde moitié des fruits restent sur la plante jusqu'à la maturation des graines, qui se termine à 42-43 jours après la pollinisation. Les graines récoltées sont désinfectés et étalées sur un milieu sélectif avec kanamycine HLH et milieu MS sélectif et contenant de la kanamycine. Après 10-14 jours, identifier les transformants pour préserver la couleur verte des feuilles de cotylédons. Les données obtenues sont présentées dans le tableau. 3.

Les principales différences par rapport au prototype de la méthode proposée sont présentées dans le tableau. 4.

Les données présentées dans le tableau. 1, on voit que le maximum de germination des embryons est observée à un taux non inférieur à embryon 2,0-2,5 mm, soit Il mesure la taille de l'embryon est plus précis et plus instructif que l'âge du fœtus, car il n'a pas observé la spécificité variétale. En utilisant des embryons 2,0-2,5 mm plus grande que, à savoir âge plus avancé du développement, n'a pas de sens, parce que la façon de contester l'accélération du processus d'obtention de transformants.

À partir du tableau. La figure 2 montre que, parmi les HLH choisi étant donné que contient des quantités plus élevées de sels, de vitamines et de saccharose, à savoir comme l'environnement le plus optimal pour la normale (sans déviation) de la germination et le développement des embryons.

Les données présentées dans le tableau. 3, on voit que l'utilisation du milieu de culture additionné de kanamycine HLH permet seulement transformé le développement normal, ie. E. résistant à l'agent de sélection kanamycine embryons.

Une analyse comparative du prototype des solutions revendiquées montre que le procédé selon l'invention se distingue du fait connu que l'utilisation d'embryons comme un explant d'une certaine taille de 2,0 à 2,5 mm et l'explant est réalisée à l'atterrissage milieu nutritif HLH. Ces différences significatives entre la méthode proposée permet la sélection de transformants par rapport à la tomate fournir connus les avantages suivants:

il devient possible d'identifier les transformants dans les premiers stades de développement des plantes (embryons), ce qui réduit l'estimation du temps et accélère le processus de sélection;

les embryons par rapport aux semences plus sensibles aux effets de l'agent sélectif;

Il exclut la possibilité d'effets toxiques des désinfectants sur les transformants, comme stérilisée fruits entiers dont les murs protéger efficacement les bourgeons;

Utiliser la culture d'embryons isolés vous permet d'explorer pleinement les bourgeons noués (y compris ceux qui ne pouvaient pas, pour une raison quelconque complètement mûres) dans le fruit et permet ainsi d'augmenter le rendement de transformants.

REVENDICATIONS

PROCEDE DE TOMATE sélection de transformants comprenant la culture des explants sur le milieu de sélection en présence de kanamycine, caractérisé en ce que les embryons sont utilisés en tant que taille de l'expiant de 2,0 à 2,5 mm, et que le milieu HLH milieu nutritif.

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Date de publication 08.03.2007gg