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invention
Fédération de Russie Patent RU2088938

Procédé pour la détection dysbiosis intestinale et les infections intestinales

Procédé pour la détection dysbiosis intestinale et les infections intestinales

Nom de l'inventeur:. Boukharine OV; AV Valyshev. Zykov LS. Assis est Konnova. Sokolov VY. Chelpachenko OE
Le nom du titulaire du brevet: Orenburg département persistance des micro - organismes Institut d'écologie et de la génétique des micro - organismes, Direction de l' Oural de l'Académie des sciences de Russie
Adresse de correspondance:
Date de début du brevet: 01.07.1993

Procédé pour la détection dysbiosis intestinale et les infections intestinales. Utilisation: dans le domaine de la microbiologie médicale, notamment dans le diagnostic de laboratoire de troubles intestinaux microbiocenosis. L'invention à découvrir cultivés sur gélose nutritive par placage colonies capacité de entérobactéries fécales pour inactiver une préparation commerciale de l'interféron leucocytaire humain à une concentration de 2 IBC pour la culture de test Corynebacterium xerosis GISCO N 181. Dans ce cas, le manque d'activité dans antiinterferonovoy colonies indique eubioz; détection de caractéristiques à 1-50% des colonies indique dysbiose intestinale, tandis que la présence d'un trait dans 50% des colonies - sur l'infection intestinale. La méthode permet d'effectuer un diagnostic précoce de dysbiose intestinale et les infections intestinales en réduisant le temps et les études plus d'information par l'évaluation pré-orientation de l'état de la microflore intestinale. La méthode peut être utilisée pour effectuer un dépistage de masse pour identifier les groupes à haut risque, et pour le diagnostic différentiel des diverses conditions intestinales microbiocenosis dans des situations cliniques et bactériologiques complexes.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention concerne la médecine, notamment pour la microbiologie médicale et peut être utilisé pour le diagnostic de dysbiosis intestinales et les infections intestinales.

Au cours des dernières années, partout il y a une augmentation significative de l'incidence de la dysbiose intestinale (dysbiose), qui est une source d'infections aiguës endogènes (péritonite, appendicite, cholécystite, pyélonéphrite, pneumonie), elle contribue au développement des maladies allergiques, la formation et la progression de l'inflammation chronique dans divers organes. microflore intestinale avec dysbiosis intestinale joue un rôle dans la carcinogenèse, l'athérosclérose est une source de gènes de résistance aux antibiotiques qui peuvent être transférées à d'autres bactéries.

En raison de la forte prévalence du problème de dysbiose intestinale de reconnaissance en temps opportun de son devenir l'une des tâches du service de diagnostic. Pour détecter dysbiose intestinale sont connus pour utiliser l'examen bactériologique élargi des fèces de manière classique avec une certaine quantité, et les propriétés biologiques de la microflore anaérobie (Epstein-Litvak RV et autres diagnostic bactériologique de dysbiose intestinale: .. Directives M. 1977). extrême diversité de la microflore intestinale (dans les matières fécales sont des représentants de 17 familles, 45 genres et plus de 400 espèces différentes) nécessite un grand nombre de milieux de culture et la création de conditions particulières pour la culture de micro-organismes. Cela conduit au fait que les méthodes de diagnostic de laboratoire de dysbiose intestinale à ce jour sont chers, beaucoup de travail, beaucoup de temps et inacceptable pour la recherche de masse.

Sur la base de ce qui précède, on peut conclure à l'importance de la détection précoce de dysbiose intestinale pour la mise en œuvre rapide et efficace de la correction de la microflore et Immunopreparat biologique. Pour résoudre ce problème nécessite des programmes de dépistage de la population pour dysbiose intestinale.

Depuis la violation de la communauté écologique intestinale toutes les propriétés de la microflore (activité antagoniste et de la vitamine-génération, la participation dans les processus métaboliques, et d'autres.) Varient considérablement, a offert une variété de tests diagnostiques indirects de dysbiose intestinale. Ainsi, les microbiocenosis étatiques jugées par le niveau des métabolites de la microflore intestinale. A cet effet, définir indican, le p-crésol et du phénol dans l'urine; hydrogène et de méthane dans l'air exhalé; volatiles teneurs en acides gras dans le jéjunum ou les matières fécales; ammoniac dans le sang dans les selles ou dans l'air expiré (AO Tamm et al. Métabolites dans le diagnostic de l'intestin intestinal dysbiose. Les antibiotiques et la biotechnologie médicale. 1987, vol. 32, N 3, s.191-195). Méthodes de détection des dysbiosis intestinale, basée sur la détection des produits du métabolisme, de fournir des résultats satisfaisants dans un déséquilibre sévère de la microflore intestinale et ont une faible sensibilité et une valeur de diagnostic dans la phase initiale de l'intestin dysbiosis (ibid, p. 192). Par conséquent, ces procédés ne sont pas suffisantes pour le criblage de populations dysbiosis intestinale. La base d'une méthode différente pour identifier les violations dysbiotic mis le degré d'activité antagoniste des micro-organismes isolés à partir des fèces (Zavgorodnyaya EF et al. L'activité antagoniste des autoflora intestinales comme une méthode indirecte de détection de dysbiose intestinale. Emploi Physician. 1981, N 6, s.113-116) . L'inconvénient de cette méthode d'évaluation de l'état de l'intestin microflore est l'étude de la durée (jour 5).

Dans le cadre des circonstances ci-dessus la recherche de nouvelles méthodes de dépistage de la dysbiose intestinale est une tâche urgente de microbiologie clinique. Au cours de la masse de la population, en particulier les examens sont les enfants, pour identifier dysbiose intestinale d'une importance considérable est la différenciation des derniers cas sporadiques d'infections intestinales. À l'heure actuelle, il n'y a pas de critères cliniques et microbiologiques clairs pour différencier ces deux maladies. Existant infections intestinales en laboratoire des méthodes de diagnostic, causées par les entérobactéries opportunistes (PEO) Escherichia, Proteus, Klebsiella, et d' autres. Sur la base de la détection de celui - ci en une quantité non inférieure à 10 UFC Juin dans 1 g de matières fécales, l' évaluation de leurs propriétés biologiques, la présence d'anticorps anti-opportunistes entérobactéries du titre 01h40 ou plus avec une augmentation de leurs niveaux dans la dynamique de la maladie dans l'étude des "paires" sérums (Queen LB et al. les mesures cliniques, le diagnostic, le traitement, l'épidémiologie et de contrôle en cas d'infection intestinale aiguë causée par des bactéries opportunistes chez les nourrissons: directives, M. 1988, p.19). Le coût élevé, l'intensité du travail, la durée des études exclut l'utilisation de ces méthodes de diagnostic des infections intestinales causées par PEO, pour le dépistage. Par conséquent, une activité spéciale devient de développer un procédé de criblage bactériologique, permettant au premier stade de l'examen (programme de recherche) afin d'identifier et de réaliser un diagnostic différentiel des maladies les plus courantes intestinales infectieuses dysbiose intestinale et les infections intestinales causées par des bactéries opportunistes.

La solution technique la plus proche choisie comme prototype, est une méthode de détermination de déficit dysbiosis intestinale de bifidobactéries (ensemencement suspension de matières fécales produites dans l'environnement Blaurock, la comptabilité par microscopie, les frottis coloration de Gram préparés à partir de colonies typiques) et la détection de la protéine tissulaire dans les matières fécales (dépôt de protéines solubles par l'addition d'acide trichloracétique à l'émulsion des matières fécales, le degré de comptabilité contrôle visuel surnageant blanchi), ce qui indique d'éventuels dommages aux éléments cellulaires de la paroi intestinale (Dorofeychuk VG, etc. les tests clés pour dysbiose intestinale:. Pristendovy feuille VDNKh 1991 à Moscou. ). L'inconvénient de cette méthode est le manque de diagnostic de dysbiose intestinale à un stade précoce, caractérisé par seulement de légers changements dans la partie aérobie microbiocenosis (augmentation ou diminution du nombre de E. coli en l'absence de réduction du niveau de bifidobactéries 1 degré de dysbiose) (Grachev, N. et al. L'utilisation d'agents biologiques bactériens dans la pratique du traitement des patients souffrant d'infections intestinales Diagnostic et traitement de l'intestin dysbiosis: .. Directives M. 1986, p 16-17) .. En outre, l'évaluation visuelle ( "complète", "grand", "petit" liquide blanchi) ne permet pas d'évaluer objectivement et de normaliser les résultats.

Ce qui précède généralisé description des méthodes identifiées Analogues avec les raisons qui empêchent la production du résultat technique nécessaire donne des raisons de conclure que l'invention revendiquée n'a pas connu de l'art antérieur, à savoir, Il est nouveau.

La grande différence est que l'activité de antiinterferonovuyu déterminée simultanément dans toutes les colonies d'entérobactéries à semer les matières fécales sur gélose nutritive avec une préparation d'interféron leucocytaire humain à une concentration de 2 IBC pour la culture de test Corinebacterium xérose GISCO N 181 et des colonies d'inactivation interféron conclure sur l'état de la microbiocenosis intestinale : antiinterferonovoy manque d'activité dans les colonies indique eubioz; détection de caractéristiques à 1-50% des colonies indique dysbiosis intestinale, tandis que la présence d'un trait de 50% des colonies sur une infection intestinale.

Les auteurs suggèrent que des différences significatives sont nouveaux et offrent la possibilité de mettre en œuvre le diagnostic précoce de dysbiose intestinale et les infections intestinales en réduisant le temps et les études plus d'information par l'évaluation pré-orientation de l'état de la microflore intestinale. Le procédé peut être utilisé pour effectuer un dépistage de masse pour identifier les groupes à haut risque, et pour le diagnostic différentiel des diverses conditions intestinales microbiocenosis dans des situations cliniques et bactériologiques complexes.

Le processus est le suivant.

Boucle rectales contenu du rectum pour la boîte de Pétri ensemencées avec 1,5% d'agar-agar contenant de la peptone de viande préparation d'interféron de leucocyte humain (ONG "Immunopreparat" Ufa) en une quantité de 0,3 ml d'une solution de 7,5 ml de gélose de travail ce qui correspond à une concentration de 2 culture test MBC Corynebacterium xerosis GISCO N 181. la solution de travail est préparée selon les instructions du flacon de soluté dans 2 ml d'une solution stérile à 0,85% de chlorure de sodium. Dans le même temps une tasse peut être semait fèces secteur à partir de deux ou trois sujets. Les cultures ont été incubées dans un incubateur pendant 18-24 heures à 37 o C. colonies paires propres de chloroforme. A cet effet, tenant la coupe à l' envers, le mettre dans un morceau de papier Whatman couvrir une superficie de 8-10 cm 2 et imprégné de ses 0,3-0,5 ml de chloroforme. Gardez tasse fermée pendant 20-30 minutes. Tournez la coupe sur le dessus des colonies et de 4,3 ml de stratifié mou (0,6-0,7%), l' agar, mélangé avec 0,1 ml de suspension (dans environ 1 ml en Septembre 10 cellules indicatrices par une norme de turbidité optique) la culture d' agar de test quotidien Corynebacterium xerosis GISCO N 181.

Les résultats ont été évalués après 18 à 24 heures d' incubation dans un thermostat à 37 ° C, i.e. au bout de deux jours après le début de l'étude. Après la période d'incubation pour déterminer le plaquage de l'activité des matières fécales sur la croissance de la souche d'essai sur la surface et autour des colonies, ce qui indique que les troubles de la microbiocenosis intestinale. activité antiinterferonovoy de détection dans 1-50% des colonies indique dysbiose intestinale; il n'y a aucune preuve de plus de 50% des colonies indique une infection intestinale, et l'absence de signes sur eubioz.

Sur la base des résultats des adultes et des enfants enquêtes recherche programme suspicion de dysbiose intestinale, ou une infection intestinale du nombre antiinterferonaktivnyh colonies peuvent être considérés comme confirmés. Le programme principal utilisé dans la deuxième étape de la recherche de diagnostic en plus du moteur de recherche, vous avez besoin de déployer des études bactériologiques des matières fécales afin de clarifier le type et le degré de dysbiose intestinale, la forme (ehsherihioza, klebsiellez et al.) Infection intestinale et une décision sur les modalités de leur correction.

Contexte théorique au développement de la méthode proposée pour la détection de dysbiose intestinale et les infections intestinales ont servi, nous avons trouvé des différences dans les colonies nombre de antiinterferonaktivnyh sur gélose cultures fèces de sujets sains et les patients présentant un dysfonctionnement intestinal (Tableau. 1).

Ainsi, lorsque l'ensemencement des fèces de 30 patients atteints d'une infection intestinale causée par EPKP 0,18, non-typable Escherichia, Klebsiella, Proteus, et d'autres entérobactéries, dans 28 cas (93,3%) ont été trouvés antiinterferonaktivnye colonie. Pour ce groupe de patients semblait antiinterferonovoy caractérisé par une activité dans la majorité (80-100%) colonies.

Lors du semis isparazhneny de 100 patients atteints de dysbiose intestinale antiinterferonovogo résultats positifs de l'essai ont été identifiés avec la même fréquence (87% des patients), ainsi que les infections intestinales. Cependant, antiinterferoaktivnyh représentait 1-50% des colonies, soit moins de la moitié cultivée sur la tasse.

L'examen clinique et bactériologiquement 30 enfants sains et les adultes dans les 27 cas (90%) dans le bordé de matières fécales ont été détectées colonies inactivant de l'interféron. Seulement 3 des 30 sondés identifié antiinterferonovy test positif, et le nombre de colonies actives sont élevées à 3-5% du adulte.

En utilisant la méthode décrite ci-dessus, il a été procédé à une étude de dépistage de 140 enfants de l'hôpital somatique CSS PO enfants "Strela" Orenburg sur le dysfonctionnement intestinal prolongé. les résultats sont présentés dans le tableau. 2.

Lorsque vous utilisez les critères de processus revendiqués (antiinterferonovoy d'activité en présence de 1-50% des colonies) de dépistage pour dysbiose intestinale positif détecté dans 22 cas sur 180 (12,2%), alors que la méthode prototype (détection de protéines de tissu en l'absence de matières fécales bifidobactéries) dans 10 cas (5,6%), P <0,05.

Dans le groupe d'enfants avec dysbiose intestinale des résultats de dépistage positifs ont été confirmés par examen bactériologique des fèces déployées comme décrit dans RV Epstein-Litvak FL Vilshanskoy (1977).

Les patients ayant un test de dépistage positif pour intestinal le diagnostic d'infection a été confirmée par la méthode bactériologique (détection de PEO en culture pure à partir des fèces d' élevage 10 -5, ce qui correspond au nombre de leurs plus Juin 10 UFC dans 1 g), et une réponse immunitaire positive de l' hôte - la présence de sérum SEA titre d'anticorps de 1: 160 et plus.

La méthode a été utilisée pour examiner trois groupes d'enfants: les premiers - les patients atteints de dysbiose intestinale; Deuxièmement, les patients atteints d'infections intestinales; troisième contrôle. Voici quelques exemples.

Le premier groupe d'enfants (patients avec l' intestin disbizom).

Exemple 1. Le patient C 10 ans. Le diagnostic sur l'admission chronique étiologie pyélonéphrite esherihioznoy en phase aiguë. Pendant la projection de la méthode proposée détectée dysbiose intestinale (le nombre de colonies lorsque plaqué antiinterferonaktivnyh fèces était de 15%), tandis qu'une enquête parallèle menée sur un prototype de selles phénomènes dysbiotic pas trouvés. De manière encore validé violation microbiocenosis intestinale conventionnelle que l' augmentation du nombre total de E. coli (4,6 x 10 Septembre CFU / g) apparition c hémolytique et lactose-formes (8 et 20%) et un bifidoflora de réduction (Octobre 7 UFC / g). Passez ciblés microflore intestinale correction biologiques. Par conséquent, la méthode proposée chez un patient diagnostiqué dysbiose intestinale dans le stade précoce de l'enquête, ce qui a permis de procéder à la correction des violations et de réduire le nombre de rechutes de pyélonéphrite.

Exemple 2. Patient R. 8 ans. Il souffre d'eczéma depuis l'âge de trois ans. L'examen bactériologique des fèces méthode proposée détecté 30% des colonies, inactivant l'interféron. Détecter les violations dysbiotic caractère définies par une analyse plus détaillée un déficit de bifidobactéries (10 5 ufc / g), et Escherichia (6 octobre UFC / g), ce qui augmente la teneur en PEO Klebsiella (Juillet 10 UFC / g).

Le second groupe de patients (patients présentant des infections intestinales).

Exemple 1. Patient M. 2 mois. De l'histoire, nous savons que l'enfant est attaché à sa poitrine le troisième jour après la naissance (hémorragie post-partum chez la mère). Après la sortie de la chaise de l'hôpital accéléré jusqu'à 8-10 fois avec du mucus. Alimentation naturelle. Derrière la masse (augmentation de 1 850 g par mois, pour la deuxième 300 g). L'examen a révélé des signes de malnutrition 1 degré. Tabouret 2-3 fois par jour, le liquide sans impuretés pathologiques. Les antibiotiques ne sont pas traités. Dans l'étude de la méthode proposée fèces réalisées sur l'admission antiinterferonovaya révélé une activité à 100% de matières fécales inoculation des colonies sur gélose nutritive interféron leucocytaire, ce qui indique que les infections intestinales. En outre l' examen clinique et bactériologique a confirmé la présence d' une infection intestinale esherihioznoy: enterpatogennaya révélé E. coli sérogroupe 018 en une quantité de 6,3 h 10 9 ufc / g avec des propriétés enzymatiques faiblement exprimés. antibiothérapie ciblée en combinaison avec des agents pathogènes a conduit à un effet positif.

Exemple 2. Patient G. 7 ans. Les plaintes de faible fièvre, la diarrhée pendant deux jours après avoir mangé des fruits secs. Au cours de l'examen clinique et de laboratoire de la méthode proposée en deux jours après la réception de l'infection intestinale définie, qui se justifie par la présence de matières fécales dans la culture à 80% de la capacité des colonies pour inactiver l'interféron. L' examen ultérieur a révélé non-typable Escherichia en une quantité de 2,1 parties Septembre 10 UFC / g, hémolytiques inactive, et une augmentation de quatre fois du titre d' anticorps à autostrains E. coli dans la deuxième semaine de la maladie.

Un troisième groupe d'enfants (contrôle).

Exemple 1. Un enfant de 5 ans. Le diagnostic à l'admission de l'énurésie. Pendant la projection des ennuis intestinaux en microbiocenosis un résultat négatif colonies antiinterferonaktivnyh ont été trouvés dans la culture des matières fécales. Eubioz a déployé confirmée par des analyses bactériologiques.

Exemple 2. Boy O. 6 ans. À l'âge de 5 ans, il a opéré sur la sténose de l'uretère prilohanochnogo. La période post-opératoire a été compliquée par une infection à Pseudomonas des voies urinaires. Trouver la source de l'infection des voies urinaires examinés par des matières fécales sur la méthode proposée. Un résultat négatif. L'examen bactériologique des fèces a confirmé eubioz. Infection des voies urinaires par Pseudomonas aeruginosa a été le résultat d'une infection nosocomiale. Application de Pseudomonas phage a entraîné la réorganisation de l'appareil urinaire.

Ainsi, la recherche microbiologique menée et les essais cliniques ont montré que la méthode proposée présente les avantages suivants: facile à tester, à prix abordable, non-invasive, ne nécessite pas d'installations et des équipements spéciaux, par rapport à l'art antérieur améliore la précision du diagnostic dans la moitié, réduit la durée de l'étude pour une journée. La possibilité d'une, voire des analyses quotidiennes répétées et un avantage de la méthode.

REVENDICATIONS

Procédé pour la détection dysbiosis intestinale et les infections intestinales par inoculation de la substance d'essai sur un support, dans lequel la détermination antiinterferonovuyu activité simultanément dans toutes les colonies Enterobacteriaceae plaquage des matières fécales sur une gélose nutritive avec une préparation d'interféron de leucocyte humain à une concentration de 2 MBC pour la culture d'essai Corynebacterium xerosis GISCO N 181 et dans l'inactivation de colonies conclure l'interféron sur l'état de la microbiocenosis intestinale: antiinterferonovoy manque d'activité dans les colonies témoignent eubioz; détection de caractéristiques entre 1 et 50% des colonies indique dysbiosis intestinale, tandis que la présence d'un trait de 50% des colonies sur une infection intestinale.

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Date de publication 30.03.2007gg