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Fédération de Russie Patent RU2200954

méthode FEATURES pour prédire l'évolution de l'hépatite B chronique chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques

méthode FEATURES pour prédire l'évolution de l'hépatite B chronique
Chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques

Nom de l'inventeur:. Ovsyannikov EG; Zaklyakova LV
Le nom du titulaire du brevet: Elena G. Ovsyannikov
Adresse de correspondance: 414000, Astrakhan, ul. Bakou, 121, AGMA, inzheneru- de S.A.Golubkinoy de brevet
Date de début du brevet: 09.01.2001

L'invention concerne la médecine, en particulier la gastro-entérologie et de l'hématologie. La méthode améliore la précision de la prévision des caractéristiques de l'écoulement de l'hépatite B chronique chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques. Effectuer l'étude immunogénétique, avec des antigènes du sang veineux est déterminée loci A, B, C, système HLA, et la présence de l'antigène HLA-B35 de prédire l'hépatite B chronique et les tumeurs malignes hématologiques, en présence de l'antigène HLA-B40 prédire l'hépatite chronisation B, en présence d'un haplotype A2 / B27 prédire la résistance à l'infection par le virus de l'hépatite B

DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention concerne la médecine, à savoir l' hématologie et la gastro - entérologie et peut être utilisé en particulier pour prédire les caractéristiques d'écoulement de l' hépatite B chronique (CHB) chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques.

De la pratique de la médecine est connu qu'une seule façon de prédire l'hépatite B chronique (Sochnev AM Alekseev LP, Tanana AT Antigènes du système HLA dans diverses maladies et la transplantation -. Riga Zinatze, 1987 -. 86c) qui consiste à déterminer le profil antigénique du système HLA.

L'inconvénient de cette méthode est que la seule méthode connue pour les patients atteints de maladies hépatiques chroniques (CDld). Les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques d'hépatite B chronique a des différences significatives de patients CDLD (état d'immunosuppression, un grand nombre de transfusions sanguines, massives charge de médicament) et d'appliquer la prédiction méthode connue de CHB est pas possible.

Le but de l'invention: pour augmenter la précision de la prévision des caractéristiques de l'écoulement de l'hépatite B chronique chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques.

Le but de l'invention est atteint en ce que les antigènes du sang veineux définissent loci A, B, C et système HLA en présence de l'antigène HLA-B35 prédire l'hépatite B chronique et les tumeurs malignes hématologiques; en présence de l'antigène HLA-B40 prédire chronisation l'hépatite B; en présence d'un haplotype A2 / B27 prédire la résistance à l'infection par le virus de l'hépatite B

Les progrès dans le diagnostic et le traitement de l'hépatite virale, réalisés au cours de la dernière décennie ont montré l'importance d'un diagnostic précoce, la possibilité de traitement et les résultats prédictifs de l'hépatite.

Prédiction de la nature de l'écoulement et l'issue des maladies est un domaine important de la médecine moderne. L'un des moyens fiables pour déterminer la prédisposition et les caractéristiques de la maladie, une étude des antigènes HLA.

Les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques sont un groupe spécial de patients pour lesquels le problème de prédire l'évolution des caractéristiques de l'hépatite chronique va à une position de leader. L'hépatite B chronique chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques sont souvent superposée sur les dommages spécifiques de la drogue et le foie existant. Le diagnostic précoce de l'hépatite B entravée par les symptômes cliniques lumineux manque, le syndrome clinique et de laboratoire de base de l'hépatite chronique B chevauchement clinique leucémie. L'immunosuppression favorise latente subclinique l'hépatite chronique B. Dans le même temps, le risque d'hépatite B infection par le virus chez les patients atteints d'hémopathies malignes est assez grande en raison de la charge de la transfusion sanguine massive et de nombreuses procédures invasives. Ainsi, il fournit une base pour l'application de la méthode des caractéristiques de l'hépatite chronique B avec hemoblastoses de prévision des flux.

Les méthodes actuelles approbated 106 patients atteints de tumeurs malignes hématologiques sur la base du service d'hématologie de l'Hôpital clinique régional Alexander et Mary I de Astrakhan dans la période 1996-2000.

Les statistiques médicales méthodes ont été utilisées dans le traitement des résultats. Pour évaluer les résultats de typage des antigènes antigènes HLA fréquence calculée sur la base de la loi de Hardy-Weinberg. Pour déterminer l'indice de fiabilité des résultats a été utilisé test non paramétrique - X 2.

Critère X 2 est calculé selon la formule Holdene, étant donné la petite taille de l' échantillon, la formule modifiée est ajustée Ieytsa a été appliqué. Les valeurs de X supérieures à 2 3841 ( ce qui correspond à p <0,05) a été considérée comme une indication de différence significative entre les fréquences des deux groupes. Pour améliorer la précision de la recherche effectuée valeurs de correction "p" par la méthode de Bonferroni (par exemple en multipliant la valeur de "p" dans le nombre d'antigènes).

En plus de l'indicateur de confiance statistique, indicateur de puissance utilisé par l'association - RR (risque relatif) - le risque relatif. La valeur du RR, qui est égale à 1, indiquant l'absence d'association. RR> 1 (association positive) indique que l'antigène est plus fréquent chez les patients; Si RR <1, il indique que le taux de l'antigène chez un patient de réduction. Dans le calcul de la RR, étant donné la petite taille de l'échantillon, la formule modifiée pour les petits échantillons a été appliqué.

HLA fréquences d'haplotypes ont été calculées par la méthode indirecte, en utilisant le degré de formule de l'indice de déséquilibre de liaison Mattiusa.

Tous les calculs ont été effectués sur un PC IBM Pentium 100, en utilisant le logiciel statistique standard.

106 patients atteints de tumeurs malignes hématologiques de nationalité russe qui ont été traités au département d'hématologie de l'OKW J'ai eu une clinique-laboratoire complète et un examen instrumental pour détecter les signes de maladie du foie l'hépatite B. La formation du groupe a eu lieu en utilisant la méthode de sélection aléatoire, l'étude a porté sur des patients présentant des signes de lésions hépatiques (augmentation des ALAT, de la bilirubine, hépatomégalie), et les patients qui ne sont pas observés ces symptômes. Tous les patients de ce groupe effectué le typage HLA des antigènes par cytotoxicité dépendante du complément. Le groupe de contrôle - 200 donneurs sains ethniques résidents russes de la région d'Astrakhan et 30 patients de nationalité russe CDLD HBsAg +.

Fig. La figure 1 présente une analyse comparative des différences dans la fréquence des antigènes du système HLA chez les patients ayant des marqueurs d'enregistrement des hémopathies malignes du VHB-infection et sans marqueurs. L'analyse a révélé que chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques avec des marqueurs du VHB, il y a une augmentation significative de l'antigène HLA-A10, A28, B21, B22, B35, B40. L'antigène HLA-B27: significativement plus élevée chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques sans HBV. Étant donné que les patients de ce groupe sont les deux principales maladies - cancers hématologiques et l'hépatite virale B, nous avons tenté de déterminer quelle maladie est marquée antigènes ou des données se déroule comme décrit par de nombreux auteurs l'aptitude d'un antigène HLA unique être un marqueur pour certaines maladies. Nous avons analysé la distribution des antigènes HLA chez les patients CDLD HBsAg + chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques avec des marqueurs du VHB.

Comme on peut le voir sur la figure 2, d'identifier le pourcentage le plus élevé dans les deux groupes a antigène HLA-B35. L'antigène HLA-B18 est révélé uniquement dans le groupe CDDL. l'antigène HLA-B40 seul groupe ainsi que la leucémie HBV-infection. L'analyse a révélé que les antigènes HLA-B35, B40 marqué HBV-risque d'infection chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques. Pour une analyse plus approfondie de cette déclaration et identifier les critères de diagnostic clinique pour l'hépatite virale B chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques, nous avons effectué une analyse comparative de la distribution de l'antigène HLA chez ces patients atteints d'hépatite virale chronique et les patients avec seulement AcHBs.

Fig. La figure 3 montre les plus grandes différences ont été trouvées pour les antigènes HLA-B35, B40: il y a une augmentation assez significative de la fréquence de l'enregistrement de ces antigènes chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques, plus l'hépatite virale chronique B et aucune différence significative dans le groupe des patients atteints de tumeurs malignes hématologiques qui ont eu l'hépatite B. Il y a une augmentation significative de la fréquence d'enregistrement antigène HLA-A28, B22 chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques d'hépatite B chronique et il n'y a pas d'augmentation significative du pourcentage de détection de l'antigène chez les patients qui ont eu l'hépatite B. Ainsi, nous avons constaté que l'hépatite B chronique chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques développées en présence de l'antigène HLA-A28, B22, B35 , B40.

Afin d'identifier des différences plus subtiles entre les groupes de patients étudiés différences haplotypes HLA ont été analysés.

Le tableau montre que la résistance à l'HBV-infection chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques marqué haplotype A2 / B27 (fréquence haplotypes H = 84,7).

Voici les résultats des tests.

exemple 1

G. Patient histoires 1421. Entré au Département de 30/01/97 plaintes de faiblesse, malaise, fièvre, douleurs osseuses, de lourdeur dans le quadrant supérieur droit. L'examen a révélé une anémie, ce qui nécessite des éclaircissements. antigène typage a été réalisée loci du système HLA de classe A, B, C par réaction limfotsitotoksichesskoy proposé en 1964 godu Terasaki.

La réaction est basée sur une action en deux étapes sur les lymphocytes du sang périphérique: 1 - anticorps sériques contenant immuns spécificité connue; 2 - complément. Pour identifier les antigènes HLA sérums kits antileykotsitarnyh gistotipiruyuschih à la classe des antigènes I ont été utilisés (panneau N 36 et N 37 loci A, B, C) et lyophilisé complément de lapin. La réaction a été réalisée à l'aide d'un mikrooborudovaniya particulier: Hamilton microseringue de 25 microlitres avec un distributeur mécanique; plaque Terasaki pour des réactions immunologiques; des tubes en plastique et 1 volume de 2 ml. La réaction a été effectuée avant le creusage sous l'huile de paraffine dans les puits de la plaque Terasaki 5 microlitres antisérums. Les plaques ainsi préparées ont été congelées et conservées jusqu'à leur utilisation dans un congélateur à une température de -20 ° C immédiatement décongelé à la température ambiante avant que le sérum de formulation de la réaction. Pendant la réaction, la solution utilisée verografin - ficoll et colorant - solution aqueuse à 5% de l'éosine. Verografin - gradient fikolovy préparé comme suit: 9% de solution aqueuse mixte (eau distillée) de solution de Ficoll ayant une masse moléculaire de 400 000 et une solution aqueuse à 32,8% verografin (verografin 60%) dans un rapport de 10:24. La solution résultante verografin-fikolovy était d'avoir une masse volumique de 1,076-1,077. Colorant - solution d'éosine 5% dans l'eau distillée ont été mélangés avant l'utilisation dans un rapport de 4: 1 avec une solution à 4,26% de chlorure de sodium hypertonique.

La réaction peut être réalisée par plusieurs méthodes, dont le plus largement utilisé a été appliqué - "deux méthodes étape" proposées par l'Institut national de la santé à Bethesda (NIH-method).

Isolement des lymphocytes: volume de sang veineux de 5,6 ml défibriné récipient, un perles à fond plat en verre contenant d-6 mm agitation uniforme pendant 10-15 minutes; a été placée dans un tube de centrifugeuse de 2 ml de Ficoll-verografin; 4 ml de sang défibriné, mélangés en quantités égales avec une solution saline a été soigneusement en couche sur Ficoll-verografin; centrifugé 20 minutes à 1500 tr / min; formé "bouffée" de lymphocytes (anneau blanc entre le gradient de densité et de surnageant) a été transféré dans un tube propre; la suspension de lymphocytes a été ajouté à 5 ml d'une solution de Hanks et on centrifuge à 1500 tr / min pendant 10 minutes pour laver le mélange de ficoll-verografin; le blanchiment a été répétée deux fois; élimination du surnageant , la concentration de la suspension des lymphocytes a été ajusté à 2-4 x 10 3 V 1 l en utilisant la solution de Hank. réaction de réglage: tube avec suspension des lymphocytes a été secoué; en utilisant une microseringue Hamilton a été ajouté à 1 litre de suspension dans la suspension des lymphocytes Terasaki puits de la plaque contenant gistiotipiruyuschie sérique (décongelé immédiatement avant la réaction); mis en incubation à température ambiante pendant 45 minutes; a été ajouté à chaque puits à 5,4 l de lapin norme complémentaire; mis en incubation dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 chasa; les plaques ont été secouées pour éliminer rapidement l'huile de vaseline; On a ajouté à chaque puits pour 1 litre de solution d'éosine 5%; après 6-7 minutes, les plaques ont été secouées pour éliminer l'excès de colorant; Les résultats ont été évalués à l' aide d' un microscope à Biolam 10 H 20.

L'évaluation a été menée par le rapport de réaction toksirovannyh (teinte) et netoksirovannyh (brillante) lymphocytes dans le champ de vision du microscope. Si les lymphocytes porteurs d'antigène spécifique de HLA, "reconnu" sérum, la lyse de la cellule de réaction se produit, qui est déterminée par la pénétration du colorant dans les cellules. La réaction est évaluée selon les critères suivants: 100% -90% de mort cellulaire - fortement positive (++++); 75% -50% de mort cellulaire - positif (+++); 50% -25% de mort cellulaire - faiblement positif (++); 25% -10% de mort cellulaire - un résultat douteux (- +). Des résultats négatifs ont été les réactions konrolya des lymphocytes avec du sérum sanguin non-toxique des personnes du groupe IV contenant pas d'anticorps anti-HLA, positif - de la réaction du sérum antilymphocytaire.

En évaluant les résultats pris en compte le principe de la «batterie». Utilisation de sérums immuns multiple de différentes séries améliore la précision des résultats et réduit le risque d'erreur.

Par conséquent, le patient a été identifié profil antigénique HLA-A3A9B12B35. La présence de l'antigène HLA-B35 a permis de prédire chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques et de l'hépatite B chronique Dans l'avenir, sur la base de tests de moelle osseuse, des tests sanguins et des réactions cytochimiques du patient a été diagnostiqué avec la leucémie lymphoblastique aiguë. Il a été prescrit protocole de traitement Heltsera (1994). Une étude approfondie pour identifier les signes de la maladie du foie (hépatite B à l'étude des marqueurs de virus dans le sérum ELISA analyse de sang biochimique, échographie). lésions signes ne pouvaient pas être détectés foie. Au cours de la chimiothérapie du patient a reçu plus de 30 transfusions. Répétée étude du sérum sanguin pendant 6 mois chez un patient diagnostiqué HBsAg, HBcAc, ABeAb, augmentation des transaminases 2 fois, le taux de bilirubine dans la plage normale, foie de phoque échographie déterminée parenchyme hépatique diffuse. Sur l'interrogatoire du patient est présenté plainte plus tôt. Ceux-ci un syndrome clinique et biologique a conduit au diagnostic de l'hépatite B chronique

Ainsi, l'étude a permis de prédire immunogénétique hémopathies malignes et de l'hépatite B chronique en présence de l'antigène HLA-B35.

Exemple 2. Patient B. histoire 854. Entré au Département de 20/01/97. Elle a observé depuis 1988 avec un diagnostic de leucémie lymphoïde chronique. Un traitement spécifique obtient 2-3 fois par an. Pendant toute la durée du traitement qu'il a reçu plus de 50 transfusions. Lorsque l'inclusion du patient dans le groupe d'enquête se plaint de la faiblesse, des douleurs dans les os, les articulations, périodiquement lourdeur dans le quadrant supérieur droit, épigastrique. De l'histoire: il y a un an, a souffert d'une hépatite B virale aiguë (avec une clinique caractéristique, la jaunisse, augmentation des transaminases 5 fois, augmenter le niveau de bilirubine en 2 fois, le sérum a été détecté HBsAg). Lorsque l'étude immunogénétique (méthode de description - Exemple 1) un profil de patient défini antigène HLA-A1A9B15B40, ce qui a permis de prédire la probabilité de l'hépatite chronique B. du patient

À l' examen: une augmentation des taux de transaminases 1,5 fois le taux de bilirubine ne change pas. marqueurs identifiés du virus de l'hépatite B par ELISA: HBsAg, NVsAb, NVeA. Échographie hépatique: parenchyme hépatique diffuse scellés. Le suivi des patients, avec un contrôle multiple de marqueurs de l'hépatite virale pour les 6 prochains mois a permis d'établir le diagnostic de l'hépatite chronique B. Ainsi, l'étude immunogénétique a prévu chronisation l'hépatite B en présence de l'antigène HLA-B40.

Exemple 3. Patient T. Histoires 5676. Entré au Département de 18/04/97. Là, dans le service d'hématologie pendant 2 ans avec un diagnostic de myélome multiple. Au cours de la durée du traitement qu'il a reçu plus de 50 transfusions sanguines et 6 cycles de chimiothérapie. Une étude approfondie pour identifier les signes de la maladie du foie (hépatite B à l'étude des marqueurs de virus dans le sérum ELISA analyse de sang biochimique, échographie). lésions signes ne pouvaient pas être détectés foie. Lorsque immunogénétique étude (description de la technique - Exemple 1) un profil de patient défini antigène HLA-A2A19B12B27 (il haplotype A2 / B27), ce qui a permis de prédire la résistance du patient à l'infection par le virus de l'hépatite B Lorsque le suivi des patients pendant 1 an avec plusieurs marqueurs de contrôle le virus de l'hépatite B, du fait de l'infection par le virus de l'hépatite B a été détectée. Ainsi, l'étude immunogénétique a permis de prédire la résistance à l'infection par le virus de l'hépatite B chez un patient en présence de multiples facteurs de risque (état d'immunosuppression, un grand nombre de transfusions sanguines, massives charge de la drogue).

La méthode proposée obtenue en améliorant la précision de la prédiction du comportement de l'écoulement de l'hépatite virale B chronique chez les patients atteints d'affections malignes hématologiques.

Les avantages de cette méthode est sa grande fiabilité, facilité d'exécution de laboratoire qui indique la possibilité d'une utilisation très répandue en gastro-entérologie, les hôpitaux d'hématologie, cliniques d'oncologie.

REVENDICATIONS

Procédé de prédiction des caractéristiques d'écoulement des patients atteints d'hépatite B chronique avec des hémopathies malignes par des études immunogénétiques, caractérisé en ce que les antigènes du sang veineux définissent loci A, B, C et système HLA en présence de l'antigène HLA-B35 prédire l'hépatite B chronique et les tumeurs malignes hématologiques, en présence de l'antigène HLA- B40 prédire chronisation l'hépatite B, la présence de l'haplotype A2 / B27 prédire la résistance à l'infection par le virus de l'hépatite B

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Date de publication 30.03.2007gg