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invention
Fédération de Russie Patent RU2104526

Procédé de diagnostic d'un lymphome à cellules T de la peau

Procédé de diagnostic d'un lymphome à cellules T de la peau

Nom de l'inventeur: Kogan Emmanuel Markovic; Zhukotsky Alexander; Kopylov Viktor Fedorovitch; Lezvinskaya Elena; Sandpiper Sergey
Le nom du titulaire du brevet: Kogan Emmanuel Markovic; Zhukotsky Alexander; Kopylov Viktor Fedorovitch; Lezvinskaya Elena; Sandpiper Sergey
Adresse de correspondance:
Date de début du brevet: 05.05.1995

Utilisation: L'invention concerne la médecine, à savoir la dermatologie et l'hématologie, destinés à un diagnostic précoce et le diagnostic différentiel de lymphome T de la peau. Procédé de diagnostic de lymphomes cutanés à cellules T (variantes érythrodermiques) par analyse cytologique de la matière biologique du patient, caractérisé en ce que la matière biologique est un frottis sanguin sont fixés, effectué le traitement de la ribonucléase, colorées avec de l'alun gallocyanine chrome mikrodensitometriruyut interphase chromatine lymphocytes sur la base de ces paramètres (OD4 - euchromatine absorbance; FORM_P - le facteur de forme du noyau; IOD2 - intégré densité optique de l' hétérochromatine; AREA - zone centrale) calcule: DF = -0,14379 B OD4 + 0,00003 × IOD2 + 10,4952 B FORM_P + 0,0001 × AREA - 11,1241 et une valeur négative de cet indicateur est diagnostiqué un lymphome T de la peau.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention concerne la médecine, à savoir, la dermatologie et d' hématologie, destiné au diagnostic et le diagnostic différentiel précoce de la peau de lymphomes des cellules T.

Le plus souvent, il est nécessaire de différencier les variantes érythrodermiques de lymphomes à cellules T et la peau érythrodermique, ce qui entraîne des dermatoses inflammatoires bénignes (eczéma, psoriasis, névrodermite et autres.). En outre, jusqu'à présent pas évalué les changements dans les lymphocytes chez les patients avec des états érythrodermiques, qui sont définis comme predlimfomnye: dermatite exfoliative Wilson, Brock et rouge algèbre de chromophytosis. Dans la pratique clinique, souvent nécessaire pour résoudre le problème de la transformation maligne dans le lymphome dermatoses inflammatoires chroniques.

Les méthodes existantes de diagnostic de lymphocytes T lymphomes cutanés ne peuvent pas satisfaire pleinement les cliniciens, car ils permettent le diagnostic que lorsque les symptômes sont sévères et consommatrices de temps dans l'exécution (immunologiques, cytochimique, cytogénétiques, et d'autres.) Et ne reflètent pas les changements dans la population de lymphocytes qui caractérisent la malignité processus.

Une des méthodes de diagnostic les plus connus est la détection de formes atypiques de lymphocytes chez les patients atteints d'érythrodermie dans malignes lymphomes T. Ceux-ci comprennent érythrodermie forme érythrodermique de mycosis fongoïde et le syndrome de Sézary, qui est maintenant considéré comme une variante leucémique de la mycose fongoïde forme de eritrodermicheskoy.

Les tentatives précédentes pour décrire les lymphocytes T anormaux (cellules de Sézary) chez les patients présentant une érythrodermie. Cependant, chacune des méthodes ci-dessous présente des inconvénients.

États histologie de eritrodermicheskoy ne reflètent pas toujours le processus de spécificité nosologique, en raison d'une forte composante inflammatoire du matériel de biopsie. Souvent, le diagnostic est requis pour que des biopsies multiples traumatisante pour le patient.

La microscopie optique permet de détecter des lymphocytes atypiques dans le sang périphérique que dans les stades avancés de la maladie, en outre, étant donné que l'analyse est réalisée visuellement, le résultat est une description qualitative de la morphologie qui ne permet pas de quantifier et d'objectiver les résultats [1].

études au microscope électronique fournissent une idée générale de la distribution de la chromatine dans les lymphocytes, mais la méthode ne permet pas d'évaluer l'état fonctionnel du génome, plutôt laborieux, en particulier dans la préparation du matériel pour l'étude [2],

La microscopie électronique à balayage peut être utilisée dans le eritrodermy d'établissement de diagnostic impossible d'obtenir des informations sur les changements dans les noyaux des lymphocytes spécifiques pour le diagnostic de [3].

Les études cytochimiques ne fournissent pas une nette différence dans la teneur des enzymes dans les lymphocytes T réactifs dans les dermatoses inflammatoires bénignes et T-lymphome malin, à savoir Aucun marqueur cytochimiques spécifiques de cellules de Sézary [4].

Cytophotométrie reflète leur lymphocyte activité proliférative sur la base d'une détermination de cellules incorporant thymidine seulement à la phase S, et ne reflète pas la redistribution qualité de la chromatine dans chaque cellule [5].

Les études cytogénétiques ont une spécificité stricte et ne révèlent pas toujours les changements pathologiques, même avec des procédés avancés jusqu'à présent [6].

Morphométrie des lymphocytes montre que le degré d'irrégularité du noyau, déterminé par le rapport de la circonférence du noyau est l'indice du contour nucléaire, qui était la plus importante dans les cellules de Sézary et les plus bas dans les lymphocytes de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique. Mais l'utilisation de seulement la méthode de morphométrie classique est impossible d'évaluer la structure fine de l'organisation supramoléculaire de chromatine dans le noyau [7].

La caractérisation immunologique phénotypiques utilisant des anticorps monoclonaux pour identifier des marqueurs tumoraux spécifiques sur les membranes des lymphocytes est le plus informatives pour le diagnostic de manifestations de lymphomes à cellules T et le diagnostic différentiel des maladies cutanées inflammatoires bénignes. Cependant, cette méthode nécessite un réactif coûteux pour diagnostiquer les lymphomes T dans les derniers stades de la maladie lorsqu'elle est exprimée lymphadénopathie infiltration et de la peau que la méthode proposée dans cette demande, et il y avait des difficultés dans la préparation matérielle pour l'étude parce le sang est prélevé à partir d'une veine, qui est plus traumatisante pour le patient souffrant de lésions cutanées [8].

Ce procédé peut être considéré comme un prototype, car il est le plus informatives pour le diagnostic des lymphomes à cellules T et le diagnostic différentiel des maladies cutanées inflammatoires bénignes.

Formulation de la réaction est réalisée en trois étapes.

I. Isolement et préparation pour la production de réaction de lymphocytes.

Prélèvement de sang de la veine cubitale et la sélection des lymphocytes par le procédé classique dans la centrifugation à gradient de densité FECO-verografin. Les comptages de cellules effectuées dans la chambre Goryaeva.

II. Préparation et réalisation de la réaction d'immunofluorescence indirecte.

Le verre dégraissé puits propres enduits de parafilm, 4 par cas. Est appliqué à chaque puits de la poly-L-lysine pour fixer les cellules. Le médicament est mis en incubation dans l'incubateur pendant 40 minutes à 37 ° C. Formulation de la réaction consiste en incubations successives. Tout d'abord - une suspension cellulaire, puis lavé et les médicaments, les anticorps monoclonaux sont appliqués aux puits. Après lavage pour éliminer les préparations d'anticorps ont été incubées avec un antisérum contre la souris Ig G, le traitement de l'isothiocyanate de fluorescéine. Ensuite, après avoir versé des agents de lavage de glycérine mélangé avec une solution saline (1: 1) et recouverte d'une lamelle couvre-objet.

III. Le comptage des sous-populations de lymphocytes T dans le microscope à fluorescence équipé d'un dispositif à contraste de phase.

Déterminer le rapport des cellules ayant un éclairage annulaire, le nombre total de cellules comptées dans le dispositif de contraste de phase, exprimée en pourcentage qui reflète le contenu de certaines populations phénotypiques et peut être attribué à la matière d'essai à une forme nosologique spécifique (processus T-limfoproliferiruyuschy). (mort) des cellules Diffusément colorées ne sont pas comptés.

La présente invention a pour but de fournir un procédé pour le diagnostic précoce et le diagnostic différentiel des lymphomes à cellules T, de la peau (variantes érythrodermiques) et la réduction des blessures du patient.

La méthode est la suivante

Préparer un frottis de sang périphérique du sang prélevé sur le doigt, fixé (par exemple, un mélange Nikiforov d'éthanol et d'éther dans un rapport de 1: 1) pendant 15 - 20 min, on le sèche à l'air. Traitement effectué ribonucléase, ribonucléase (Reanal, BHP) dilué dans une solution de saccharose osmolarité à une concentration de 200 ME / 100ml. Le traitement dure 50 - 60 minutes à une température de 37 o C, après quoi un frottis est lavé en 3 changements d'eau distillée. L'alun de solution de production de couleur gallocyanine-chrome (MCC), préparé par la procédure standard [9] pendant 3 - 4 heures à 37 o C. Le produit est lavé avec 4 - 5 minutes, l'eau du robinet établie.

Après coloration formulation et recouvert d'un verre de couverture mikrodensitometricheskoe a mené des recherches sur le système d'analyse d'image. microdensitomètres résulte des caractéristiques optiques, topologiques et géométriques du composant interphase chromatine (et de euchromatin hétérochromatine) et le noyau dans son ensemble.

Auparavant, sur des échantillons de formation ont été mis en place pour cette indicateurs les plus informatifs de la structure de la pathologie interphase chromatine:

OD4 - euchromatine absorbance;

FORM_P - le facteur de forme du noyau;

IOD2 - densité optique intégrée de l'hétérochromatine;

AREA - zone centrale.

Pour une évaluation complète de ces indicateurs sont calculés paramètre: DF = -0,14379 B OD4 + 0,00003 × W IOD2 + 10,4952 FORM_P + 0,0001 × AREA - 11,1241.

La formule pour calculer le paramètre DF obtenu en utilisant une analyse discriminante linéaire [10] en utilisant un progiciel statistique standard. Une valeur négative de l'indicateur DF diagnostiqué avec un lymphome T de la peau.

Un lien similaire entre les valeurs numériques établies lors de l'examen des groupes de patients traités à la clinique de la peau MONICA sur le lymphome à cellules T de la peau (11 personnes) et dermatoses bénignes inflammatoires (psoriasis et dermatite atopique - 10 personnes). L'analyse a montré les indicateurs les plus significatifs de la structure de la chromatine en interphase lymphocytes du sang périphérique, a calculé le paramètre dérivé DF pour identifier le lymphome T de la peau.

Exemple 1. Patient B ,, 63 ans, N histoire - 7646, Monica.

Il est entré dans la clinique avec les plaintes des rougeurs, des démangeaisons, brûlures, frissons.

Le diagnostic clinique: le lymphome T de la peau, le stade érythrodermique.

Pendant le traitement, la clinique proposé dans la présente demande signifie la chromatine des noyaux interphasiques des lymphocytes du sang périphérique des patients a été étudiée, et la méthode standard utilisée par la préparation d'un frottis de sang total prélevé sur un doigt. L'air de frottis séché résultant, fixé avec Nikiforov. En outre, en éliminant les effets de l'acide ribonucléique traitement des résultats d'analyse de la ribonucléase a été réalisée. Ribonucléase dilué une solution de saccharose à une concentration osmolaire de 2000 E pour 100 ml de solution. Préparations traitées dans cette solution pendant 1 heure à 37 ° C, après quoi elles ont été lavées dans 3 changements d'eau distillée. En outre, les agents de coloration en solution MCC. solution MCC est préparé par la procédure standard [9]. La coloration est effectuée pendant 3 heures dans un thermostat à 37 ° C, après quoi les préparations ont été lavées pendant 5 minutes avec le surnageant de l' eau du robinet.

Les médicaments fréquemment intégrés dans le baume du Canada et examinés après séchage sur le système d'analyse d'image.

Les indicateurs de la structure de la chromatine pour examiner le patient:

OD4 - 3,02207; FORM_P - 0,82145; IOD2 - 39080,8; AREA - 7938,7.

Indicateur d'évaluation plus intégrée DF = -0,9710674 a été calculé,

La valeur de la DF <0; Par conséquent, le patient a révélé des changements dans la structure de la chromatine interphase de cellules T approprié lymphome de la peau, ce qui coïncide parfaitement avec les données de la recherche clinique et de laboratoire.

Exemple 2. Patient B., 40 ans, N Histoires 14762, Monica.

Il est entré dans la clinique de la peau Monica se plaignant de rougeurs, plus sur les membres inférieurs, des démangeaisons.

Le diagnostic clinique: atopiques.

Avec la méthode proposée est étudiée la structure de la chromatine des lymphocytes du sang périphérique du patient (voir. Exemple 1).

Les indicateurs de la structure de la chromatine pour examiner le patient:

OD4 - 4,48286; FORM_P - 0,938331; IOD2 - 74411,4; AREA - 13686.

De plus l'indicateur d'évaluation intégrée a été calculé DF = 1,6802235.

La valeur du DF> 0, par conséquent, des changements de structure de la chromatine identifiés correspondent à des changements dans les dermatoses inflammatoires bénignes.

Exemple 3. Patient G., 56 ans, l'histoire N - en 1497; MONICA.

Il est entré dans la clinique avec les plaintes de rougeur de la peau, de la fièvre.

Le diagnostic clinique du psoriasis.

Avec la méthode proposée est étudiée la structure de la chromatine des lymphocytes du sang périphérique du patient (voir. Exemple 1).

Les indicateurs de la structure de la chromatine pour examiner le patient:

OD4 - 3,26156; FORM_P - 0,933456; IOD2 - 79238,4; AREA - 14092,6.

De plus l'indicateur d'évaluation intégrée a été calculé DF = 1,9901397.

La valeur du DF> 0, par conséquent, des changements de structure de la chromatine identifiés correspondent à des changements dans les dermatoses inflammatoires bénignes.

Exemple 4. Patient D., 48 ans, N histoires - 16105, Monica.

Admis à l'hôpital avec des plaintes du changement de couleur de peau (rougeurs), des démangeaisons, des frissons, des brûlures, des picotements. Malade depuis l'enfance, il a dit rechutes saisonniers chaque printemps et en automne, les 3 dernières années, sans rémission. Auparavant traitées avec des antihistaminiques environ la dermatite atopique.

Le diagnostic clinique au moment de l'admission: lymphome T de la peau.

Les données cliniques sur l'admission: la peau couleur stagnante-bleuâtre, 100% érythrodermie, infiltration sévère, lymphatiques périphériques élargie noeuds tous les groupes, en particulier les fémoral et inguinale (jusqu'à 4-5 cm).

Avec la méthode proposée est étudiée la structure de la chromatine des lymphocytes du sang périphérique des patients (voir. Exemple 1).

Les indicateurs de la structure de la chromatine pour examiner le patient:

OD4 - 4,78724; FORM_P - 0,944441; IOD2 - 66646,9; AREA - 11071,9.

De plus l'indicateur d'évaluation intégrée a été calculé DF = 1,206237183.

La valeur du DF> 0, par conséquent, des changements de structure de la chromatine identifiés correspondent à des changements dans les dermatoses inflammatoires bénignes.

L'examen de la clinique dans les frottis de sang périphérique, le patient a trouvé des cellules de Sézary simples (explosions, grand-variante similaire), mais à la fin de la biopsie de l'étude - névrodermite (typique).

Le tavegilom de traitement, le charbon actif, gemodez, kleritinom le patient a noté une amélioration de la santé, la réduction de l'érythème et de la peau infiltration.

Ainsi, notre examen clinique des patients et l'efficacité du traitement ont confirmé la présence de patients atteints de dermatose inflammatoire bénigne (névrodermite).

Exemple 5. Patient P., 80 ans, l'histoire N - 9743, Monica.

Admis à l'hôpital avec des plaintes de démangeaisons, des rougeurs, de la fièvre, des picotements, sensation de brûlure. Sick depuis 1970, précédemment traités avec prednisolone sur la dermatite atopique.

Au cours des 4 mois avant la présente admission aux patients hospitalisés ont été examinés dans une clinique de la peau MONICA avec diagnostic suspecté de dermatite exfoliative-Brock Wilson.

Le résultat de l'examen histologique de la biopsie de la peau: change érythrodermie généralisée plus cohérente.

Le diagnostic clinique au moment de l'admission: dermatite allergique.

Les données cliniques sur l'admission: la peau est rouge vif; infiltration prononcée, 100% érythrodermie, amincissement des cheveux, marqué hyperkératose sur les paumes et les plantes, axillaire modérément élargie, inguinale et les ganglions lymphatiques fémorales.

Avec la méthode proposée est étudiée la structure de la chromatine des lymphocytes du sang périphérique des patients (voir. Exemple 1).

Les indicateurs de la structure de la chromatine pour examiner le patient:

OD4 - 4,10798; FORM_P - 0,820714; IOD2 - 42548,7; AREA - 8391,45.

Indicateur d'évaluation plus intégrée DF = -0,9856234 a été calculé.

La valeur de la DF <0; changements donc identifiés correspondent à des changements dans la structure de la chromatine avec lymphome T de la peau.

L'examen a révélé des changements dans la clinique dans le sang périphérique (lymphocytes - 72%, les cellules de Sézary - 15%); biopsie a confirmé le diagnostic de lymphome T: cindrom Sézary, infiltration diffuse avec microabcès polymorphisme en grande infiltrat multi-cellules.

La coïncidence des résultats des tests effectués en utilisant la méthode proposée et le tableau clinique suggère une méthode de spécificité de diagnostic des lymphomes T, la peau (des variantes érythrodermiques).

Ainsi, par rapport au prototype, la méthode de diagnostic précoce et le diagnostic différentiel des lymphomes à cellules T, de la peau permet:

a) identifier la forme maligne de lymphocytes dans les premiers stades, quand il est pas détecté des cellules de Sézary et établir un diagnostic avant l'apparition de manifestations cliniques;

b) un diagnostic différentiel Etats eritrodermicheskoy avec lymphome T de la peau et des dermatoses inflammatoires bénignes;

c) pour réduire le patient traumatisé par une maladie de la peau, comme le sang pour la recherche ne sont pas prises à partir d'une veine, et du doigt.

RÉFÉRENCES

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9. E. Pierce histochimie. - M., 1962, p. 190-192, 746.

10. A. Afifi, analyse statistique S. Eisen: une approche à l'aide d'un ordinateur. Trans. de l'anglais. - M:. Mir, 1982. - 488 p.

REVENDICATIONS

Procédé de diagnostic de lymphomes cutanés à cellules T (variantes érythrodermiques) par analyse cytologique, prélevé chez un patient de la matière biologique, caractérisé en ce que le matériau biologique prélevé sur un frottis sanguin sont fixés, effectué le traitement de la ribonucléase, colorées avec de l'alun gallocyanine chrome mikrodensitometriruyut interphase chromatine lymphocytes sur la base de ces paramètres (OD 4) , la densité optique de euchromatine, FORM_ P facteur de forme du noyau; IOD 2 intégré densité optique de l' hétérochromatine; AREA zone centrale), calcule le DF -0,14379 OD × 4 + 0,00003 × 1OD 2 + 10,4952 W FORM_P + 0001 W AREP 11,1241 et une valeur négative de cet indicateur est diagnostiqué un lymphome T de la peau.

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Date de publication 01.04.2007gg