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invention
Fédération de Russie Patent RU2080598

PROCÉDÉ DE DÉTERMINATION lymphocytes T activés dans l'organisme humain

PROCÉDÉ DE DÉTERMINATION lymphocytes T activés dans l'organisme humain

Nom de l'inventeur: Frolov Alexander K. [UA]; Shipityak G. Eustace [UA]; Negustorova Alla Fedorovna [UA]; Lupinos Oksana Vitalevna [UA]; Piskun Marina Nikolaevna [UA]
Le nom du titulaire du brevet: State University Zaporozhye (UA)
Adresse de correspondance:
Date de début du brevet: 03.09.1992

Utilisation: la médecine et en ce qui concerne l'identification dans les lymphocytes T humains activés. L'invention échantillonnage conduite de sang d'un doigt ou d'une veine dans des tubes contenant un anticoagulant, les lymphocytes isolés lymphocytes utilisés pour la production de la formation de rosettes spontanée avec des moutons de globules rouges sans l'incubation à froid ( "de sortie immédiate») dérivés et le nombre de lymphocytes, d'attacher plus de 10 moutons globules rouges, est déterminée activé . La méthode permet d'augmenter l'objectivité de l'évaluation, afin de simplifier la définition et de réduire le temps de l'analyse de l'activité fonctionnelle des lymphocytes directement dans le corps humain.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention concerne la médecine, à savoir des procédés pour des études immunologiques et concerne l'identification dans les lymphocytes T humains activés.

méthode connue pour déterminer les lymphocytes T dans le sang, y compris la sélection des lymphocytes, en y ajoutant des erythrocytes de mouton incubation pendant au moins une heure à 4 ° C, la préparation de formulations et leur analyse sur le nombre d'érythrocytes adhérents [1] Pour les lymphocytes T prennent les cellules , fixer au moins trois érythrocytes de mouton. Cependant, seul le nombre de lymphocytes T peut être déterminée par cette méthode sans détermination de leur activité dans l'organisme.

Connu et un procédé pour déterminer les lymphocytes T activés dans le sang humain, comprenant les lymphocytes en culture de 48 54 heures dans un milieu de culture de mitogene phytohémagglutinine (PHA) stimulés pour proliférer dans une culture à prédominance de lymphocytes T, l'administration de colchicine arrêtant la cuisson division des lymphocytes stade de la métaphase préparations chromosomiques et leur analyse cytogénétique [2] la méthode est basée sur l'analyse des lymphocytes en passant la première division mitotique, association chromosomes acrocentriques qui sont suivies cytogénétique (signe) de la prolifération précédent et la migration des organes lymphoïdes périphériques chez les humains. Pour les lymphocytes activés prises sans associations et deux acrocentriques associant formés par une série de divisions mitotiques, qui sont détruits lorsque l'association. Cette méthode est assez complexe (il est nécessaire de cultiver des cellules dans des conditions stériles, pour arrêter la division cellulaire colchicine comme chromosomes peuvent être étudiés seulement à la métaphase de la mitose), inaccessible pour l'adoption de masse de (réactifs rares nécessaires, l'équipement coûteux), mais exige également un certain exécutif de qualification ( la valeur de la culture cellulaire, la possession de la méthode cytogénétique). Cette méthode est pas suffisamment objective, dans le cadre des lymphocytes dans la culture sont tués et non pas tous les lymphocytes vivant entrer dans le cycle cellulaire mitotique lors de la fixation.

Le but de la méthode est d'accroître l'objectivité de l'évaluation, la simplification de la définition et de réduire le temps d'analyse de l'activité fonctionnelle des lymphocytes directement dans le corps humain.

L'objectif est atteint par le fait que, dans le procédé connu consistant à déterminer l'activité des lymphocytes signes résiduels de l'antigène d'activation et de la prolifération dans les organes lymphoïdes périphériques, effectuer la formation de rosettes spontanées avec des moutons globules rouges sans l'incubation froid ( «sortie immédiate»), dans une préparation en compte le nombre d'érythrocytes adhérents pour les lymphocytes T (avidité), et le nombre de lymphocytes T, pour fixer plus de 10 moutons globules rouges, est déterminée activée.

analyse comparative de la solution revendiquée au prototype montre que la méthode proposée est différent du fait connu que le nombre de lymphocytes T activés est déterminé par analyse de l'avidité des lymphocytes T aux globules rouges de mouton dans un frottis, préparé à la mise en scène de la formation de rosettes spontanées avec des globules rouges de mouton sans suspension d'incubation ( "sortie immédiate »). Les lymphocytes T activés sont fabriqués par la fixation de plus de 10 globules rouges de mouton. échantillon ainsi obtenu des lymphocytes est pas nécessaire de cultiver, d'ailleurs, son volume peut être réduit au minimum (0,5 à 0,6 ml) et permet objectivement distinguer les lymphocytes du sang total pour les prises de contrôle, ce qui simplifie grandement le procédé et le rend disponible pour skreniruyuschih de recherche. Ainsi, la solution revendiquée répond au critère de la «nouveauté».

Il existe des solutions techniques procédé de formation de rosettes spontanées avec des moutons globules rouges mise en scène sans l'incubation froid ( «sortie immédiate») (2, 4, 5). Cependant, ces solutions techniques (3, 4, 5) n'a pas été isolé et fonctionnellement justifiée classe avidement des lymphocytes T, pour fixer plus de 10 moutons globules rouges, manquant ainsi d'atteindre l'objectif, les lymphocytes T à savoir d'allouer activés dans le corps. Par conséquent, les méthodes (3, 4, 5) établir et réviser "sorties immédiates" sont quantitative plutôt que qualitative.

Aucun connu des solutions techniques, dans lesquelles l'activité des lymphocytes du sang est déterminé par le nombre de moutons globules rouges attachés à eux dans le processus de mise en une prise immédiate. Détermination de activé test de rosette de lymphocytes T sans fraction froide par les lymphocytes vysokoavidnyh d'incubation à érythrocytes de mouton (joindre plus de 10 érythrocytes de mouton) dans la préparation est explicitement ne pas être l'art antérieur. En conséquence, la solution revendiquée répond à l'exigence de «activité inventive».

La méthode proposée est la suivante. Effectuer le prélèvement de sang dans les veines des doigts ou des tubes avec un anticoagulant, des lymphocytes isolés, leur concentration a été ajustée à 2,0 x 10 6 cellules par 1 ml du mélange nutritif constitué de milieu 199 et 10% de sérum de fœtus bovin adsorbé contre les ovins et les érythrocytes humains, inactivé à 56 ° C pendant 30 minutes. Ensuite, 0,1 ml de la suspension de lymphocytes ont été mélangés avec 0,1 ml d'une suspension à 0,5% de moutons lavé des globules rouges dilué dans le même milieu que les lymphocytes. Les cellules ont été incubées dans un incubateur pendant 10 minutes à 37 ° C, centrifugées 5 minutes à 200, des douilles fixes en ajoutant 0,05 ml de 3% pendant 20 minutes à la température ambiante, on l'a lavé libre de la solution retenue par le glutaraldéhyde en excès (pH 7,2 7,4) eau distillée et centrifugation à 1000 tr / min pendant 5 minutes. Le surnageant a été éliminé, laissant un volume de 0,1 à 0,2 ml, dans lequel les cellules sont soigneusement remis en suspension et des frottis préparés dégraissés sur des lames de microscope. Frottis fixé 5 min dans du methanol et mikroskopiruyut tachée. La formulation de l'étude de 400 lymphocytes dans quatre sites différents du médicament. lymphocytes Rozetkoobazuyuschie sont regroupés en trois avidement Classe 1 Classe 3 6 Fix les érythrocytes de mouton, 2ème classe 6 et 10 troisième classe de plus de 10 érythrocytes de mouton. Au dernières actions de classe activés lymphocytes T déterminés au moment de la prise de sang pour l'analyse.

La base de l'affirmation selon laquelle une sous-population de lymphocytes circulants, rejoint plus de 10 moutons de globules rouges, est un sous-ensemble de lymphocytes activés, sont la preuve de leur dynamique particulière des personnes en bonne santé et malades (voir tableau.), Mais également détectée élevée (r 0,8 - 0,9 ) corrélation positive de la proportion de lymphocytes avec une fréquence de classes de lymphocytes sans l'association et deux acrocentriques associant. Selon le prototype de ces classes de lymphocytes cytogénétiques et sont activés par des antigènes, formées dans les organes lymphoïdes périphériques après une série de divisions mitotiques avec l'agent immunogène. Une forte corrélation positive entre les données comparées obtenues de diverses manières, montre l'uniformité de l'analyse des sous-populations de lymphocytes circulants. Ce sont les membres d'un pool de lymphocytes sous-population de postproliferativnogo, nouvellement formé dans les organes lymphoïdes périphériques à immunogenèse disponible en réponse à des antigènes dans le corps et de nombreux antigènes du soi. Par conséquent, ces lymphocytes sont activés. Après une série de divisions mitotiques (6-10 fois), les sous-populations de lymphocytes activés migrent vers des organes lymphoïdes périphériques dans la circulation générale et devient disponible pour l'analyse dans le prélèvement de sang. Lorsque les chromosomes mobiles association des chromosomes détruit ou est le nombre minimum, qui est, ils constituent une classe de lymphocytes sans l'association et deux acrocentriques associant. En outre, les lymphocytes T nouvellement formée est une haute densité de type membrane 2 antigènes. Par conséquent, ils sont vysokoavidnymi aux érythrocytes de mouton et en contact avec eux attachés plus de 10 érythrocytes de mouton. Dans les longues-circulation (jours, semaines, mois) de lymphocytes intacts type de densité 2 antigènes est réduite parce que stadiodiferentsirovanny cet antigène est impliqué principalement dans les processus antigennezavisimoy activation des lymphocytes. Par conséquent, non-activé (temporairement intactes) lymphocytes T sont fixés moins (<10) moutons globules rouges.

La fréquence des lymphocytes activés parmi le pool de lymphocytes circulants dépend de l'intensité de leur formation dans les organes lymphoïdes perfiericheskih, mais également sur l'activité et la direction de leur migration vers le foyer pathologique antigénique, comme indiqué dans le tableau.

Nous avons étudié la fréquence des lymphocytes activés au moyen du procédé revendiqué et le prototype du prochain contingent de personnes:

  • donneur sain de 10 personnes;
  • patients oncogènes avec exsudative pleurésie kantseroznoy étiologie de 9 personnes.

Le tableau montre la fréquence de rosette T-lifotsitov obtenu par un procédé d'incubation froid caractérisant le total des lymphocytes T, et sans incubation "sortie immédiate" froid caractérisant la sous-population T-limifotsitov avec une densité accrue des récepteurs aux érythrocytes de mouton (type 2 antigène) .

Le tableau montre que l'incidence globale des "prises immédiatement" dans tous les échantillons de lymphocytes est nettement inférieure à la fréquence des points communs et correspond à la literaty de données [3] Sans le temps d'incubation à froid pour former une sortie seules les cellules ayant une densité plus élevée des récepteurs CD 2. Analyse de la fréquence des classes d'avidité de sang et l'exsudat pleural montre que seulement vysokoavidnye lymphocytes T appartenant à la troisième classe à la méthode de réglage exposition caractéristique de la dynamique de la situation immunologique sortie immédiate. Ainsi, la fréquence des lymphocytes, pour fixer plus de 10 moutons globules rouges dans l'exsudat pleural 1,5 2 fois ou plus supérieure à la fréquence des lymphocytes dans le sang. Une telle dynamique dans le sang et le plasma, a été détectée pour la classe de lymphocytes sans l'association et deux acrocentriques associant (KL 0 + 2).

Lorsque l'analyse corrélative KL fréquence 0 + 2 dans le plasma sanguin et a constaté que l'activité cytogénétique des lymphocytes T était significativement plus élevée (r 0,82 et 0,85, respectivement) est en corrélation uniquement avec la fréquence des lymphocytes T, a rejoint plus de 10 moutons globules rouges dans la fabrication de méthode rosette sans incubation à froid.

Ces différences de lymphocytes T activés dans les tests de tsitonneticheskom et rosette dans le sang et l'exsudat pleural ont émergé grâce à un redéploiement, à savoir la migration à partir du sang et le dépôt dans les poumons, où l'antigène est localisé puissant foyer (métastase).

Dans le sang de donneurs sains, la fréquence moyenne des "sorties immédiates" et socket globale inférieure et cette réduction est due à la part des lymphocytes T vysokoavidnyh troisième année. En outre, entre ces derniers et la fréquence du CR 0 + 2 a une plus forte corrélation positive.

La fréquence vysokoavidnyh dynamique résultant de moutons érythrocytes lymphocytes T et leur corrélation étroite avec la fréquence du CR 0 + 2 confirment leur activité immunologique. Par conséquent, le taux de fréquence des lymphocytes T, a rejoint plus de 10 moutons globules rouges dans le test "prise immédiate" est un test fonctionnel de l'activité des lymphocytes T en circulation. Le total des lymphocytes indicateurs de fréquence des rosettes avec et sans tests d'incubation froids froids sont quantitatifs et non significativement corrélées avec les indicateurs fonctionnels des lymphocytes T.

Circulant corps T-lymphocytes, rejoints par un 10 mouton globules rouges ont une densité plus élevée des récepteurs (type 2 antigènes) comme une indication de leur activation résiduelle précédente dans les organes lymphoïdes périphériques correspondants. Type 2 antigène est impliqué dans les contacts cellule-cellule, l'antigène provoquant la prolifération et la différenciation (non spécifique) des lymphocytes komitirovannyh [6] Sa complémentarité aux érythrocytes de mouton, et donc la connexion avec eux par accident. Ceci est illustré par une augmentation de l'avidité des lymphocytes (le nombre d'érythrocytes adhérents) dans leur stimulation mitogénique non spécifique de lectines dans les conditions de culture in vitro, en une heure après l'addition d'un mitogene (PHA, konkavanavalina Un pokeweed mitogen), même en l'absence de synthèse de l'ADN [7, 8]

Par conséquent, une augmentation de la densité de l'antigène de type 2 est un signe précoce de l'activation des lymphocytes T. Dans les organes lymphoïdes périphériques et les lymphocytes spécifiques de l'antigène après l'activation des cellules antigennespetsificheskoy d'blastiques transformées avec une haute densité de l'antigène CD2, et donc avec une grande avidité à des erythrocytes de mouton. Ensuite, ces cellules se divisent par mitose dix fois Juin et différenciés antigenreaktivnyh clone de lymphocytes T qui laissent les organes lymphoïdes, y compris le pool de lymphocytes T en circulation. Les lymphocytes T nouvellement formés conservent une forte densité de récepteurs 2 diabète et mis à disposition pour l'analyse en prenant un échantillon de sang. Au cours de la poursuite de l'ontogenèse des lymphocytes T membrane de densité type antigène diabète 2 est réduite.

Ainsi, la dynamique vysokoavidnyh lymphocytes T, plus de 10 moutons attach globules rouges, a été déterminé par "prise de courant instantané» de manière opérationnelle et le contrôle de l'intensité de la prolifération et la migration des lymphocytes T activés; leur redistribution dans le corps à des endroits de dépôt d'antigènes; étudier l'intensité de l'immunité et sa correction en utilisant la thérapie immunotropique.

SOURCES D'INFORMATION

1. EF Chernushenko, LS Kogosova, SI Goncharova et d'autres. Méthodes immunologiques unifiée de l'examen des patients dans le traitement des patients hospitalisés et ambulatoires. recommandations méthodiques. Kiev, 1988, 18, p.

2. AK Frolov VK Frolov. Procédé de détermination de lymphocytes T activés dans le sang. AS N 1024839 01 C 33/50, 1986, un prototype.

3. G. Frimel. Immunological méthodes / ed. avec elle. M. Medicine, 1987, 472 p.

4. UN Cheredeyev, DV Pledra, KK Stolongo. L'étude des cellules formant des rosettes spontanées dans le sang périphérique humain. Lab. affaires 1976, N 6, 350-354 p.

5. J. I. Karpov FR Mokhov, NI Volkov. Réaction des lymphocytes rosettes spontanés isolés du sang capillaire. Lab. affaires, 1984, N 7, 427-429 p.

6. Immunologie clinique et allergologie. En 3 volumes. T. 1. Trans. avec elle. / Ed. Jaeger. 2e éd. révisée et élargie. M. Medicine, 1990, 528 p.

7. Ju David, Tar janvier Heman lymphosyte subpomilation: Gigant humains rosetfes de globules rouges J. Jmmand. Meth. 1977. v.15 N1. p. 67 76.

8. Richie E. Patchen M. Corrélation et de l'engagement des lymphocytes achivation. Ceen. Jmnuind. N 73). 11. N V 1978 1, p. 88 97.

REVENDICATIONS

Procédé de détermination de lymphocytes T activés dans le corps humain, y compris le prélèvement de sang et on isole des lymphocytes de celui-ci, caractérisé en ce qu 'une formulation avec des lymphocytes obtenus à la formation de rosettes spontanées avec des erythrocytes de mouton sans incubation froid et le nombre de lymphocytes, fixer plus de 10 activé erythrocytes de mouton déterminer T les lymphocytes dans le corps.

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Date de publication 02.04.2007gg