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invention
Fédération de Russie Patent RU2036235

Procédé d'inactivation de virus dans le sang et ses composants

Procédé d'inactivation de virus dans le sang et ses composants

Nom de l'inventeur: Harald Mohr [DE]; Bernd Lambrecht [DE]
Le nom du titulaire du brevet: der Blutshpendedinst Landesferbende Des Deutsche Rothen Kroytses Niedersachsen, Oldenburg und Bremen gGmbH (DE)
Adresse de correspondance:
Date de début du brevet: 01.03.1992

Utilisation: la virologie, la biotechnologie.

L'inactivation virale selon l'invention est mise en oeuvre dans le sang ou ses composants, en mélangeant la solution a été traitée ou d'une suspension avec un colorant phénothiazine, et l'irradiation ultérieure avec de la lumière, dans lequel le colorant de type phénothiazine est utilisé en une concentration de 0,1 à 10 moles, dans lequel l'irradiation est réalisée directement dans des récipients transparents qui sont utilisés pour capturer et le stockage du sang.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention se rapporte à lutter contre les virus, en particulier l'inactivation du virus dans le sang et des composants sanguins.

Procédé virus d'inactivation est connu dans lequel les virus dans un liquide sont mélangés dans un ballon avec un colorant phénothiazine, suivie d'une irradiation avec de la lumière (voir. Snaypes V. et al., 1979 g. Photochem. et Photobiol. 29, pp. 785-790). Lors du transfert d'une méthode connue pour inactiver les virus dans le sang et les composants sanguins, on a trouvé que cela a eu lieu, non seulement l'inactivation des virus, mais aussi des protéines du plasma sanguin tels que les facteurs de coagulation.

Le but de l'invention est de développer un procédé simple pour inactiver les virus dans le sang et les composants sanguins, dans lequel les différents types de virus sont tués sans effet significatif sur la fonction des protéines plasmatiques du sang.

Le problème est résolu dans un procédé d'inactivation de virus dans le sang et les composants sanguins traités par le mélange d'une suspension ou d'une solution de colorant phénothiazine et l'irradiation ultérieure avec de la lumière en raison du fait qu'un colorant phénothiazine est utilisé dans une concentration de 0,1 à 10 micromoles, dans lequel l'irradiation est réalisée directement dans des récipients transparents, employés pour la collecte et le stockage du sang. On effectue l'irradiation avec la lumière du jour ou d'une source de lumière d'intensité suffisante monohromatnym est de préférence une lumière froide ayant une longueur d'onde proche du maximum d'absorption du colorant correspondant. En outre, lorsque inactiver les virus dans le plasma ou les solutions de protéines de plasma sanguin du sang, les conditions suivantes doivent être respectées. température de travail doit être d' environ 0 à -37 C, mais il est possible d'inactivation 20/04 C. Le processus se poursuit, en particulier de 5 minutes à 5 heures, de préférence de 10 minutes à 3 heures. Le pH du milieu doit être traité 5- 9, de préférence 6-8.

On a constaté que le virus ne possède pas la peau, tel qu'un adenovirus qui ne peut être inactivée dans le plasma dans les conditions physiologiques, les méthodes peuvent être photosensibilisé par congélation et décongélation subséquente, il est alors possible de réaliser avec succès inactivée. Ainsi, l'inactivation peut être réglé indépendamment du gel de séquence de réception et la décongélation subséquente et l'addition d'un colorant. Sous processus de congélation surgélation est entendu gaz liquefactioned comme liquide de refroidissement à une température d'environ -20 ° Cà 80 C. En règle générale, la congélation est effectuée à une température de -30 ° C

L'inactivation du virus peut être effectuée directement dans des sacs destinés à la conservation de sang ou de plasma sanguin, bien que ces sacs ont seulement limité la transmission lumineuse. Dans ce cas, la méthode proposée permet de réduire l'addition du colorant, suivi par l'irradiation du sac et de son contenu. Ensuite, le produit correspondant peut encore être traité.

Ainsi, le procédé proposé peut être réalisé avec des moyens techniques simples et, par conséquent, il peut être intégré dans le processus de traitement du sang dans les mémoires respectives. Une petite quantité de colorant ajoutée peut être ensuite transformé en un liquide. Si nécessaire, elle peut être enlevée avec le récipient. Le sang de longue durée et ses composants sont compris: le sang total, des globules rouges concentrés, concentrés de plaquettes, sang, plasma, sérum, krioosadok concentrés de facteurs de coagulation, des inhibiteurs, la fibronectine, l'albumine.

La méthode proposée utilise phénothiazines suivant la formule structurelle

Procédé d'inactivation de virus dans le sang et ses composants. Fédération de Russie Patent RU2036235

Tableau. La figure 1 représente les valeurs de X, R 2, R 3, R 7.

Procédé d'inactivation de virus dans le sang et ses composants. Fédération de Russie Patent RU2036235

exemple 1
Photoinactivation virus soumis vésiculaires stomatitny dans le plasma humain en présence de bleu de méthylène. En même temps , environ 5 × 10 7 unités de taches solaires par ml de virus en suspension dans le plasma sanguin humain et mélangé avec du bleu de méthylène, appliquées en différentes concentrations. Les échantillons de contrôle ne contiennent pas de colorant. Le volume d'échantillon est de 0,5 ml. Une partie de l'échantillon de contrôle et des échantillons contenant le bleu de méthylène a été irradié avec une lumière visible à la température ambiante pendant 4 heures. Le reste de l'échantillon a été conservé pour la même période de temps. La source lumineuse est un projecteur équipé d'une lampe à halogène de 150 watts. La distance entre la lentille du projecteur de diapositives, t. E. L'ouverture de décharge de lumière, et des échantillons dans toutes les expériences est de 30 cm (sauf pour l'inactivation du virus dans le sang des sacs de stockage). Après irradiation, les échantillons du titre viral est déterminé par l'analyse des taches. Comme indicateur séché les cellules BHK (ATCC N SSS10). Les résultats expérimentaux sont résumés dans le tableau. 2.

Procédé d'inactivation de virus dans le sang et ses composants. Fédération de Russie Patent RU2036235

Table de données. 2 indiquent que, étant donné que la concentration de bleu de méthylène de 0,5 mmol, infectieux titre viral est diminué de plus de 6 degrés décimaux.

exemple 2
Ce test confirme l'inactivation du virus à de faibles concentrations de colorant.

Des portions aliquotes de volume de plasma sanguin de 500 ul contenant le virus vésiculaires stomatitny et différentes quantités de bleu de méthylène, est soumis à une irradiation par des moyens placés à une distance de 30 cm de rétroprojection dans la chambre frigorifique. Les échantillons A à E est irradié, et l'échantillon F est non exposée.

Les résultats des essais sont résumés dans le tableau. 3. Ils montrent que, dans ces conditions, ledit virus est inactivé par plus de 4 degrés décimaux. Ceci requiert une concentration de bleu de méthylène, qui est égale à 0,5 micromolaire. Une nuit d'incubation à 4 ° C réduit probablement le titre de virus par 1-2 point décimal qui peut être une explication de la relativement faible titre initial. Mais ce fait n'a pas été étudié en détail.

Résultats Comparaison d'inactivation Un échantillon irradié avec l'échantillon F (uniquement le stockage dans le noir) montre que l'une lumière a apparemment peu d'effet sur l'infectivité virale.

exemple 3 :
Les virus de la dépendance à l'égard photoinactivation en présence de colorants de phénothiazine la durée d'exposition. Ainsi sunspot Juin 10 unités par ml mises en suspension dans des échantillons de plasma et on irradie comme décrit dans les exemples précédents de manière à 22 ° C pendant indiquée dans le tableau. 4 temps. Selon le tableau. La figure 4 montre que, dans ces conditions, une exposition d'une heure est suffisant pour réduire le titre du virus infectieux vésiculaire-stomatitnogo pendant plus de 6 degrés décimaux.

exemple 4
L'exemple 3 est répété avec la différence que l'inactivation est effectuée en présence de 1 mole de bleu de toluidine. Les résultats des tests, résumés dans le tableau. 5 indiquent que le virus vésiculaires stomatitny peut être inactivée efficacement en présence d'un bleu de toluidine.

En présence de colorants de phénothiazine peuvent inactiver le virus zoster de bulles et de HSV et un virus VIH-1 du SIDA, comme le montrent les résultats des exemples 5 et 6.

exemple 5 :
NSV l'inactivation du virus est effectuée en présence de 1 mole de bleu de méthylène. Tableau. 6 résume le HSV cinétique du virus de photoinactivation.

exemple 6
L'inactivation du virus HIV-1 est effectuée en présence de bleu de méthylène à 1 micron. Ainsi , le titre du virus était de 6 × 10 2 unités de taches solaires / ml et utilisé comme un indicateur de cellules MT4 (HTLV-1 lignée cellulaire T-lymphoblastoïdes infectées est humain). Les résultats des tests, résumés dans le tableau. 7 indiquent que le virus HIV-1 qui est très sensible à la photoinactivation que dans les 10 premières minutes du titre viral est diminué de plus de 600 fois.

exemple 7
Inactivation des virus enveloppés ne sont pas dans des conditions physiologiques normales, en présence de 80% de plasma n'a pas abouti. Dans ce virus adénovirus utilisé à titre d'exemple non revêtu, qui est préincubé dans ledit tableau. 8 fois à 4 ° C dans l'obscurité , en présence de 1 mole de bleu de méthylène. Ensuite, l'exposition de 30 minutes à l'aide d'une luminosité de la lampe halogène de 150 000 lux. Ainsi infectiosité adénovirus reste inchangé. Les résultats des essais sont résumés dans le tableau. 8.

En appliquant le bleu de toluidine dans les mêmes conditions expérimentales, et ne réduit pas le titre du virus est observée.

Pour atteindre processus d'inactivation de l' adénovirus comprennent des techniques de congélation-décongélation (ci - après "pour / dans"), le gel est effectuée à -30 ° C Les méthodes pour la séquence / temps et en ajoutant le colorant (bleu de méthylène 1 mol) ne jouent qu'un rôle mineur . Irradiation des échantillons est effectuée en utilisant des ampoules à halogène 120.000 lux. Les résultats des essais sont résumés dans le tableau. 9.

exemple 8 :
Cette expérience a pour but d'étudier l'influence du colorant à des concentrations différentes sur l'activité des facteurs de coagulation. Dans le même temps aliquotes de 2 ml de plasma humain a été mélangé avec diverses quantités de bleu de méthylène. Immédiatement après l'addition du colorant est mesurée à l'activité des facteurs de coagulation V, VIII et IX. Comme on le voit à partir du tableau. 10, tous les facteurs de la coagulation inhibée, en fonction de la concentration de colorant, t. E. Ingibatsiya les facteurs V et VIII commence avec une concentration d'environ 10 microns, et le facteur IX déjà inhibée par la présence du colorant dans une concentration d'environ 2,5 microns. Ainsi, le bleu de méthylène à une concentration plus élevée affecte directement les protéines sans exposition à la lumière.

Les résultats des essais sont résumés dans le tableau. 10.

exemple 9
Dans l'activité des facteurs de coagulation affecte non seulement la concentration du colorant, mais le temps d'exposition. Cette relation est étudiée dans cet exemple. Pour ce faire, des aliquotes (2 ml) de plasma humain a été mélangé avec diverses quantités de bleu de méthylène et a été exposée comme décrit dans l'exemple 1 est suivi pour les échantillons 1-4 h. Le contrôle non soumis à un traitement photographique. Table de données. 11 montrent que l'activité des trois facteurs de coagulation V, VIII et IX est inhibée en fonction de la durée d'exposition et la concentration de colorant. En particulier, les facteurs de coagulation VIII et IX données indiquent qu'une concentration plus élevée de l'irradiation et de la lumière bleue méthylène avec une durée de 2 heures conduit évidemment à une augmentation de l'effet thrombolytique.

exemple 10
Photoinactivation de virus selon l'invention est réalisée directement dans des récipients transparents servant à l'échantillonnage et le stockage du sang ou de ses composants, après addition préalable du colorant dans la quantité souhaitée. Ainsi d'une manière simple, vous pouvez à tout moment de manipuler du sang et de ses composants de donateurs individuels.

Dans cet exemple, trois échantillons sont décongelés plasma humain frais, qui , dans leurs conteneurs, le virus vésiculaire stomatitnogo 1,5 unité × 10 6-sunspot. Les deux échantillons sont ajoutés au bleu de méthylène à une concentration de 1 micromolaire et 10, respectivement. Parce que ne contenant pas de méthylène échantillon de plasma bleu est prise, qui , comme un contrôle positif stocké dans l'obscurité à 4 o C. Puis, toutes les capacités pleksiglasnymi serrées entre deux plaques de manière à fournir une épaisseur de couche uniforme d'environ 2,5 cm. Containers irradié à l' aide d' un projecteur de diapositives, placé à une distance de 90 cm. au bout de 4 heures, l'échantillon prélevé afin de déterminer le titre viral pour alimenté à des cellules FL. Les résultats des essais sont résumés dans le tableau. 12.

Table de données. 12 indiquent que même une concentration en micromoles de bleu de méthylène est suffisante pour réduire le titre de virus infectieux vésiculaires stomatitnogo supérieur à trois degrés décimaux. Même en l'absence d'irradiation colorant effectuant une réduction du titre du virus, mais seulement environ 50%

A des concentrations allant jusqu'à 1 micromolaire utilisé pour inactiver les virus colorants phenothiazine peuvent rester dans le sang ou ses composants, sans effets secondaires. Mais ils peuvent être éliminés par dialyse, filtration sur gel ou par adsorption. Le plus d'intérêt est adsorbé car il est associé à la moindre quantité de temps et de la technique, et en outre, les solutions de protéines respectives ne nécessitent pas de dilution. Il a été constaté que le bleu et d'autres colorants de phénothiazine méthylène se lient aux différents gels, disponibles dans le commerce, y compris la séparation de tels gels qui ne possèdent pas la capacité de lier des protéines ou sous-développés ont seulement leur capacité à se lier. Ainsi, de tels adsorbants sont particulièrement appropriés pour l'élimination des photo-oxydants. Parmi les adsorbants étudiés pour la séparation de méthylène colorants bleu et d'autres phénothiazines peuvent être appliqués avec succès les agents sont énumérés dans le tableau. 13.

Dans la plupart des cas, l'extraction complète des protéines plasmatiques à partir d'une solution de bleu de méthylène à une concentration de 10 micromoles assez 2g adsorbant approprié. Deux types d'adsorbants se sont avérés particulièrement appropriés.

1. La silice avec un diamètre de pores de 40 à 100 Qui ne permettent pas de protéines plasmatiques de pénétrer dans la matrice. Mais les faibles molécules de colorant de poids moléculaire se lient à effet fiable de ionique, électrostatique et des interactions hydrophobes. Des exemples de ces adsorbants sont Matreks publiques Silica Gel société étrangère Amicon, Witten, Allemagne, daltozil entreprise étrangère Serva, Heidelberg, en Allemagne, et une société étrangère Kieselgel Merck, Darmstadt, Allemagne.

2. Gels à base de polymères de polystyrène-divinylbenzène, ou des esters d'acide acrylique. Des exemples de gels disponibles dans le commerce, ces types sont Amberlites produits, par exemple, une société étrangère Rohm und Haas, Frankfurt am Main, Allemagne, et bio BIDS société étrangère Bio Rad, Munich, Allemagne. Ils servent principalement à retirer ou d'agents tensioactifs non polaires, ces agents de nettoyage à partir de solutions aqueuses. Ils sont non-polaire ou faiblement polaire.

exemple 11
Frais de plasma sanguin a été mélangé avec 10 moles de bleu de méthylène (m. P.). Des portions aliquotes de 5 ml ont été mélangés avec diverses quantités de diamètre daltozil (pores 75 ) Et BIDS bio CMS de diamètre 16 (des pores 144 ), Respectivement, puis on a agité pendant 30 min. Ensuite, le gel est laissé décanter. Pour déterminer la teneur du plasma sanguin, du Facteur VIII et le Facteur V, l'extinction à 660 nm et une teneur en protéines dans certains échantillons.

Les résultats des essais sont résumés dans le tableau. 14.

Selon l'extinction vu que, avec le colorant à partir du plasma sont extraits évidemment encore d'autres substances, qui cependant ne constituent pas les protéines plasmatiques. Les données pour l'extinction du plasma traité adsorbant 100-250 mg par 5 ml, à savoir 5/2 en poids. / Volume diffère peu de celle des échantillons de données d'extinction qui ont été extraites avec 10 poids. le volume / échantillon d'adsorbant. Par conséquent, lorsque la concentration de bleu de méthylène à 10 microns est suffisante pour utiliser l'adsorbant 05/02 en poids. / Volume de l'échantillon, de sorte que dans le cas du procédé discontinu pour éliminer complètement le colorant à partir du plasma. À des concentrations plus faibles de colorant nécessite un débit plus faible de manière correspondante de l'adsorbant.

exemple 12
Dans cet exemple, le plasma est utilisé au lieu de 5% de sérum albumine humaine (ci-après SYD). Dans cette expérience, la concentration de bleu de méthylène de 10 micromoles. Aliquotes de 5 ml d'extraction avec 100 mg (2 volumes en poids). Après adsorbants: daltozil (diamètre des pores 75 ), Un gel de silice (diamètre des pores 40 ) Et BIDS bio CMS de diamètre 16 (des pores 144 ).

Les résultats des essais sont présentés sur le dessin. Comme on peut le voir que, dans tous les cas, l'extinction à 660 nm diminue, i.e. suffisamment de temps spécifié pour l'élimination périodique de la solution de protéines photo-oxydant. Et le dessin montre que dans ce cas bio adsorbants BIDS et 16 CM silice avec un diamètre de pores de 40 Ils sont plus efficaces que daltozil avec un diamètre de pores de 75 .

exemple 13
Cet exemple étudie la possibilité d'enlèvement d'adsorption de bleu de méthylène d'une solution de protéine plasmatique par Chromatographie sur colonne. La base de cette méthode sur l'idée que, après l'inactivation des virus à l'aide de colorant et en irradiant la solution de protéines de plasma peut être passé à travers une colonne d'adsorbant et, de là introduit dans le réservoir supplémentaire, qui sert pour le stockage de la solution traitée. Cette colonne peut être placée entre deux réservoirs. Ainsi, l'assemblage préalable peut fabriquer, composé de deux conteneurs placés entre la colonne d'adsorption. Il est ainsi possible de créer un système fermé, ce qui réduit le risque d'infection est beaucoup inactivation virale passé de la préparation de protéines plasmatiques, y compris les préparations provenant de donneurs individuels.

Ce test est effectué comme suit.

250 ml. une solution d'albumine à 5% a été passée à des vitesses différentes à travers une colonne contenant 5 ml de gel de silice avec un diamètre de pores 40 . Des fractions de 10 ml sont recueillies et l'absorbance à 660 nm. Selon le tableau. 15 que toute la solution d'albumine peut être transmise à un taux de 7,5 et 5 ml / min, respectivement, à travers la colonne sans être en fractions obtenues pourraient prouver l'existence de résidus de bleu de méthylène. Par conséquent, l'élimination du colorant à partir de 250 ml de solution nécessite pas plus de 30-35 minutes.

Les résultats de cette expérience montrent que l'élimination chromatographique de photo-oxydants peut être effectuée sans aucun problème. D'autre part, il prouve la possibilité d'obtenir les virus inactivés susmentionnés contenant des protéines plasmatiques préparations de donateurs individuels.

REVENDICATIONS

  1. PROCEDE DE VIRUS DE L'INACTIVATION DE SANG ET SES COMPOSANTS traités par mélange avec une solution ou suspension de colorant phénothiazine et l'irradiation ultérieure avec de la lumière, dans lequel ledit phénothiazine colorant est utilisé en une concentration de 0,1 à 10 micromoles, et l'irradiation est réalisée directement dans des récipients transparents qui sont utilisés pour la capture et le stockage sang.

  2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'utilisation du bleu de toluidine ou le bleu de méthylène comme phénothiazine.

  3. Procédé selon la revendication. 1 ou 2, caractérisé en ce que l'irradiation est réalisée par la lumière visible à l'absorption maximale du colorant correspondant.

  4. Procédé selon l'une des revendications. 1 à 3, dans lequel l'irradiation est effectuée à un pH de 5 Septembre.

  5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'irradiation est effectuée pendant 5 300 minutes.

  6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'irradiation est effectuée à 0-37 ° C.

  7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution ou de la suspension traitée est soumise à une congélation préliminaire suivie d'une décongélation avant l'irradiation.

  8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le colorant est ajouté avant le processus de congélation.

  9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le colorant est ajouté après la décongélation.

  10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu 'après l'irradiation du sang ou de ses composants est passé à travers un adsorbant pour éliminer le colorant.

  11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que, pour sa mise en oeuvre fait appel à deux conteneurs adaptés pour le prélèvement de sang, placé entre eux avec la colonne d'adsorption.

  12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que l'agent adsorbant est utilisé dans le groupe consistant en gel de silice, à base de polystyrène-divinylbenzène, les polymères d'esters de l'acide acrylique.

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Date de publication 08.11.2006gg