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Fédération de Russie Patent RU2043767

Procédé d'inhibition de l'infection par le VIH

Procédé d'inhibition de l'infection par le VIH

Nom de l'inventeur:. AV Asaph; Bezyulev VV. Anosova IG
Le nom du titulaire du brevet: recherche et de production des entreprises "Farmek"
Adresse de correspondance:
Date de début du brevet: 24.05.1993

L'invention concerne la médecine et peut être utilisé pour inhiber l'infection par le VIH qui provoque le SIDA chez l'homme. L'essence de l'invention consiste en ce que pour la suppression de l'infection par le VIH en utilisant des complexes d'ADN exogène avec des métaux polyvalents. La méthode a une activité antivirale élevée avec une faible toxicité.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention concerne la médecine, à savoir la virologie, et peut être utilisé pour inhiber l' infection à VIH qui provoque le SIDA chez l' homme.

L'augmentation de la morbidité et de la mortalité du SIDA augmente à l'impossibilité d'un traitement efficace, il est pertinent pour la recherche de nouveaux médicaments pour lutter contre le VIH.

Les procédés connus pour inhiber l'infection à VIH, comprenant l'administration des analogues nucléotidiques, en particulier de 3-asu-3-désoxythymidine-AZT. Cependant, ce médicament est efficace dans les premiers stades de la maladie, et même à des doses thérapeutiques est très toxique, ce qui donne une complication clinique (maux de tête, l'anémie, les troubles du tractus gastro-intestinal), ce qui limite son utilisation. Des procédés connus, comprenant l'administration nucléosides diftorirovannyh, analogues nucléosidiques liposome, mais leur efficacité est faible.

Le but de l'invention est de développer un procédé efficace pour inhiber l'infection par le VIH, qui combine une efficacité élevée avec une faible toxicité.

La méthode proposée réside dans le fait qu'ils utilisent des complexes de sel de sodium de l'acide désoxyribonucléique (ADN) avec des métaux polyvalents (zinc, le nickel, le cobalt, le fer) dans le rapport de 1: 1 à 1: 1000, et l'administration de la préparation est effectuée par voie sous- cutanée, intraperitoneale, intranasale ou canal spinal selon la forme de la maladie dans une dose thérapeutiquement équivalents.

Les caractéristiques essentielles de l'invention doivent être pris en considération dans le processus en utilisant le sel de sodium de l'ADN complexé avec des métaux polyvalents, selon les indications précédemment inutilisées, leurs proportions et les doses et les schémas d'administration et des formulations. Pour la première fois la possibilité d'obtenir un effet antiviral à différents modes d'administration du médicament, ce qui est très important dans les différentes formes cliniques du SIDA, pulmonaires, gastro-intestinaux, des lésions du système nerveux central.

ADN sel de sodium des composés métalliques complexes, se compose de faible teneur en sel de sodium de poids moléculaire d'ADN, nizkopolimernoy contient au moins 80% du sel de sodium de l'ADN natif provenant de l'esturgeon laitance, et présente les caractéristiques suivantes: Mol. 270-500 m 10 3 Dalton effet hyperchrome: 37% à moins de 1% en poids de protéine, pas plus de 17% d' humidité en poids, les rapports molaires des nucleotides adenine thymine 29,0 27,0 22,0 guanine, la cytosine et 20,0 métalliques polyvalents à savoir le zinc (Zn), le cobalt (Co), le nickel (Ni), le fer (Fe).

Pour supprimer le VIH dans des systèmes in vitro en utilisant des complexes ADN-Na avec le zinc, le cobalt, le fer et le nickel à des concentrations différentes des composants. entreprises "Wellcome" ont utilisé la comparaison de production AZT. L'activité antivirale de la préparation a été évaluée en utilisant les méthodes recommandées par l'OMS à cet effet. la culture ont été utilisés des lignées cellulaires continues CEM-SS et MT-4. Les cellules ont été cultivées à une concentration (de 0,03 à 0,05) x 10 5 cellules par 1 ml de milieu RRMI 1640 avec 10% de sérum de veau foetal, 300 mg / ml de L-glutamine, 100 pg / ml de gentamycine et cultivées en suspension. La viabilité des cellules a été vérifiée par les taches d'une solution de bleu de trepanovogo 0,4%. En tant que source des souches virales utilisées VIH / IVS-1 et le VIH, le HTLV / IIIB.

La suspension cellulaire a été placée dans un puits 24 panneaux ont été traités avec différentes doses du médicament et le infectés par le VIH. La multiplicité d'infection était de 0,01 TPA 50 par cellule. Les cultures ont été incubées à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 98% d' humidité pendant 5-7 jours jusqu'à ce que le virus de la détermination de l' effet cytopathique dans une culture cellulaire.

Pour évaluer la formation de l'antigène viral immuno-enzymatique utilisé.

Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

Dans le tableau ci-dessus montre que, lorsqu'il est introduit dans le milieu de culture de l'ADN-métal marqué suppression de l'infection du VIH in vitro. En outre, le rapport optimal de l'ADN-métal se situe dans l'intervalle de 1: 1 à 1: 1000. Cet effet viralstatic combinée à une faible cytotoxicité. Lorsqu'il est introduit dans le milieu de culture du médicament AZT ont une cytotoxicité élevée avec effet antiviral modéré.

Par la suite, la toxicité des médicaments en utilisant la méthode proposée a été testée chez des animaux expérimentaux dans le système in vivo.

Les essais ont été menés en parallèle sur l'ensemble des quatre préparations codées par rapport à l'AZT à des doses de 5, 10, 20, 35 et 50 mg / kg. Les études de toxicité et de quatre médicaments non linéaire azidothymidine menée sur des souris albinos pesant 6-7 g en utilisant différentes concentrations de médicament par kilogramme de poids corporel des animaux dans un volume de 0,2 ml sous la forme de sous-cutanée, intranasale et injection intrapéritonéale et 0,03 ml de volume sous la forme d'injection intracérébrale . Les animaux ont été gardés en observation pendant 2 semaines, puis LD 50 a été calculée par la méthode Curber. Pour une dose de LD 50 a pris une dose létale de médicament qui a causé la mort de 50% des animaux.

Les résultats des études sur la toxicité de ces préparations sont donnés dans le tableau 2.

Les tableaux montrent que les cinq médicaments, quelle que soit la dose sont non toxiques pour les souris blanches pesant 07.05 g sous-cutanée, intra-nasale, l'administration intra-abdominale (temps d'observation de 2 semaines). En même temps, on a enregistré une mortalité de 50% chez les souris à des doses supérieures à l'ADN-Na-Fe 50 mg / kg pour une administration par voie intracérébrale. Azidothymidine et a provoqué la mort de 50% des souris à une administration intra-cérébrale à des doses de 10 à 50 mg / kg de poids animal. De façon caractéristique, les complexes, pratiquement tout mode d'administration, l'activité antivirale est maintenu, en même temps que celle de l'AZT est mieux exprimée en administration intracerebrale, sous-cutanée et intraperitoneale.

Les complexes proposés de Na-ADN-métal possèdent une activité marquée anti-VIH; leur activité anti-virale associée à une faible toxicité, pratiquement tout procédé d'administration d'une dose de 10-50 mg / kg et manifeste une activité antivirale pratiquement toute voie d'administration.

EXEMPLE Exemple 1 L'expérience a utilisé une culture de cellules de lignes continues CEM-SS et MT-4. Les cellules ont été cultivées à une concentration de 0,03- 0,05 · 10 6 cellules par 1 ml de milieu RRMI 1640 avec 10% de sérum de veau foetal, 300 ug / ml de L-glutamine, de 100 pg / ml de gentamycine et cultivées en suspension. La viabilité des cellules a été vérifiée par coloration avec une solution à 0,4% trepanovogo bleu. En tant que source des souches virales utilisées VIH / IVS-1 et le VIH HT2V / IIIB. La suspension cellulaire a été placée dans un puits 24 panneaux ont été traités avec diverses doses d'un ADN-Na-Zn complexe dans un rapport de l'ADN et métal (M / M) 1: 1; 4: 9; 3:10; 0,5: 350; 1: 1000; 1: 1100 et infectés par le VIH. La multiplicité d'infection était de 0,01 DNT 50 par cellule. Les cultures ont été incubées à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 98% d' humidité pendant 5-7 jours jusqu'à ce que le virus de la détermination de l' effet cytopathique dans une culture cellulaire. Pour évaluer la formation de l'antigène viral immuno-enzymatique utilisé.

Dans l'expérience, on a montré que le nombre de syncytia en pour cent de contrôle de l'ADN viral dans un rapport de 03:10 en métal est de 25% à 69% de cellules viables; à un rapport de 0,5: 350-35% à 81,2% de cellules viables; selon un rapport de 1: 1000 de cellules viables de 70% et à 84,3% à un rapport de 1: 1100 à des cellules viables à 100% et 86,2%.

Exemple 2. Exemple expérimental que dans l'exemple de production 1.

La suspension cellulaire a été traitée avec diverses doses d'un ADN-Na-nickel complexe dans le même rapport des composants comme dans l'exemple 1. L'expérience montre que le nombre de syncytia en pour cent du contrôle par le virus à ADN nickel 0,5 03:10 350 égalaient zéro pour la viabilité des cellules 71 et 79% à 1: 1000 avec 68% de cellules viables à 84,3% à un rapport de 1: 1100 à 87,5% au niveau des cellules viables à 100%.

Exemple 3. Exemple expérimental que dans l'exemple de production 1.

La suspension cellulaire a été traitée avec diverses doses d'un complexe ADN-Na-Co sous le même rapport pondéral des composants comme dans l'exemple 1. L'expérience montre que le nombre de syncytia en pour cent du contrôle par le virus à ADN-Na-Co 03:10 correspond à 10% de viabilité 78,4% de cellules à un rapport de 0,5: 350-15% de viabilité cellulaire à 87,1 dans un rapport de 1: 1000 avec 66% de viabilité et de 76,3% à 1: 1100, respectivement, la viabilité était de 82,1%

Exemple expérimental 4. Exemple de formulation comme dans l'exemple 1.

La suspension cellulaire a été traitée avec diverses doses de-Na-fer d'ADN complexe, avec les mêmes proportions des constituants qu'à l'exemple 1. L'expérience montre que le nombre de syncytia en pour cent du contrôle par le virus à ADN-Fe 3:10, 0,5: 350 0 correspond à la viabilité des cellules, respectivement 79,3 et 82,1%, lorsque le rapport de Fe ADN de 1: 1000 le nombre de syncytia dans 61% de viabilité cellulaire à 81,7, selon un rapport de 1: 1100 à 100% à 84,5% de viabilité

Ainsi, ces exemples illustrent la forte activité anti-HIV de la méthode proposée avec une faible toxicité.

Un tel procédé est par rapport au connu présente les avantages suivants: une activité anti-VIH élevée en combinaison avec une faible toxicité et efficaces à faibles doses pour tout mode d'administration qui permet de sélectionner une voie appropriée d'administration du médicament sous différentes formes cliniques du SIDA. La méthode peut être recommandée pour une étude clinique.

REVENDICATIONS

PROCEDE DE SUPPRESSION DU VIH comprenant l'administration d'une préparation d'acides nucléiques, caractérisé en ce que la préparation dérivée de l'esturgeon laitance, contenant au moins 80% du sel de sodium de la masse moléculaire d'ADN native 270500 × 10 3 D en un rapport molaire de 29,0 nucléotides adénine, la thymine, 27,0, 22,0 guanine, la cytosine 20,0, en combinaison avec un métal polyvalent non toxique , dans un rapport molaire 1 1 1 1000 , qui est administré par voie sous - cutanée, intrapéritonéale ou dans le canal médullaire, en fonction de la forme clinique de la maladie, le choix de la dose thérapeutique appropriée.

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Date de publication 06.01.2007gg