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invention
Fédération de Russie Patent RU2205410

Procédé pour la préparation d'un sérum anti-idiotypiques pour le diagnostic de tumeurs malignes

Procédé pour la préparation d'un sérum anti-idiotypiques pour le diagnostic de tumeurs malignes

Nom de l'inventeur: Panteleev Dmitry Y .; Shein Yuriy Germanovich
Le nom du titulaire du brevet: Panteleev Dmitry Y .; Shein Yuriy Germanovich
Adresse de correspondance: 121609, Moscou, Automne Boulevard, 11, (609 bureau de poste), Société "VIS", pat.pov. NA Triposhinoy, identification No 472
Date de début du brevet: 19.05.2000

L'invention concerne la médecine, à savoir l'immunologie, et peut être utilisé pour le diagnostic de maladies malignes. Le procédé consiste en ce que, dans un système syngénique, la première étape de produire de manière significative l'administration à un animal des cellules de tissu chorionique foetales syngéniques correspondant à des souris de 12,7 jours tissus embryonnaires obtenues à partir de l'animal femelle enceinte du même système syngénique, dans une deuxième étape par après 5-14 jours après l'entrée des cellules embryonnaires prélevées sur un leucocytes des animaux immunisés et les introduire dans le corps d'un syngénique des animaux avec la précédente, et après 4-12 jours après la dernière immunisation, le sérum a été préparé par échantillonnage du sang de l'animal, qui est laissée à la température ambiante pour former un dense caillot, puis centrifugé pour la vitesse de sédimentation complète; sérum recueilli, chauffé à 60 ° C résultant d'adsorber des cellules animales d'homogénat syngéniques en excès, suivie d' une centrifugation et la filtration. Aux deux étapes peuvent traiter agents antimitotiques entrée de cellules ou en introduisant les immunostimulants, ou le remplacement d'une fraction entière de la membrane des cellules. Le résultat technique est d'augmenter l'efficacité et la fiabilité du diagnostic des maladies tumorales malignes.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention concerne la médecine, à savoir l' immunologie, et se rapporte à un procédé de production antiembrionalnoy de sérum anti-idiotypique utilisé en tant qu'agent pour le test d' un patient pour le diagnostic du cancer.

Selon l'hypothèse préliminaire dans le processus de croissance de la tumeur et de l'embryogenèse, il (fonctions) de mécanisme similaire de intercellulaire (intermembranaire) réaction, à l'appui de cette hypothèse propose l'utilisation d'un sérum antiembrionalnoy anti-idiotype, dont l'effet peut être essentiel pour la détection de la croissance tumorale et / ou la progression tumorale. sérum similaire utilisé pour créer une méthode universelle pour le diagnostic des tumeurs malignes (voir. URSS n ° 1836640, G 01 N 33/80, publ. 23.08.93).

méthode connue pour diagnostiquer un cancer en examinant la vitesse de sédimentation sous l'action des deux agents - sérums anti-idiotype antiembrionalnoy et des sérums témoins en même temps que le premier agent est un sérum de rat, et le second - le sérum de rats qui avaient des lymphocytes préalablement introduits des animaux syngéniques (voir brevet RF 2.111.495. , G 01 N 33/80, publ. 20.05.98). Et le diagnostic est de trouver le taux de sédimentation sur gradient minimum et maximum des globules rouges dans les données de sérums de patients et le calcul en fonction d'un coefficient de croissance maligne de la formule, la valeur qui indique la présence / l'absence d'une tumeur maligne.

Dans ce procédé, le sérum antiembrionalnaya idiotypique utilisé en tant qu'agent de modification de la vitesse de sédimentation des globules rouges du patient par rapport au sérum témoin dans le cas de la présence de la croissance des cellules tumorales malignes.

La présente invention traite la tâche de création d'un anti-idiotype propriétés de antiembrionalnoy sérique qui permettrait de contrôler visuellement la présence de la croissance des cellules de tumeurs malignes, quelle que soit la histogénèse, détectable au microscope à fluorescence. Le résultat technique est possible d'augmenter l'efficacité et la fiabilité du diagnostic des maladies tumorales malignes.

Ce résultat technique est obtenu par le fait que la préparation d'un système syngénique sérum antiembrionalnoy anti-idiotypique dans la première phase produire l'administration de façon fiable syngéniques animale 7-12 jours d'âge des cellules embryonnaires du tissu chorionique obtenu à partir de femelles gestantes dans la deuxième étape après 5-14 jours après être entré dans les cellules embryonnaires prélevées sur les leucocytes des animaux imunnogo et les introduire dans un autre organisme, un animal syngénique précédent, et après 4-12 jours après la dernière immunisation, la formation d'un composant quantité de imunnogo suffisante dans le sérum sanguin de l'animal est obtenu par prélèvement de son sang qui est laissé à la température ambiante pour former un caillot dense, puis centrifugée pour obtenir des sédimentation; sérum recueilli, chauffé à 60 ° C résultant d'adsorber des cellules animales d'homogénat syngéniques en excès, suivie d' une centrifugation et la filtration.

Aux deux étapes peuvent traiter agents antimitotiques entrée de cellules ou en introduisant les immunostimulants, ou le remplacement d'une fraction entière de la membrane des cellules.

En nombre «suffisant» de la composante immunitaire signifie que la concentration des immunoglobulines (classe G et M) dans le sang de l'animal, ce qui permettrait d'exécuter des techniques de diagnostic décrites ci-dessous. «Suffisant» (ou la concentration de la classe immunitaire globuline G et / ou M) peut être évalué par d'autres procédés connus, par exemple:

a) la réaction de transformation blastique des lymphocytes, ou

b) la réaction de précipitation, ou

c) dosage immuno-enzymatique, ou

d) radioimmunodosage, etc.

La méthode proposée suppose que le produit final, ce qui est le sérum immun d'un animal immunisé prise lors de la phase finale. Par exemple, dans le cas de deux étapes d'échantillonnage du sang d'immunisation est effectuée à partir de l'animal immunisé 2 dans le cas de la vaccination en 3 étapes de l'animal 3, etc.

composant immunitaire, obtenu dans la dernière étape peut être:

a) des cellules immunitaires qui produisent des globulines immunitaires classe G et / ou F, ou

b) des anticorps monoclonaux qui sont basés sur lesdits lymphocytes ou

c) les immunoglobulines G réelles et / ou F, ou

d) des fragments Fab des immunoglobulines (C), ou

e) Le total sérum comme l'option la plus simple.

Ces caractéristiques sont essentielles et reliés entre eux pour former une combinaison stable des caractéristiques essentielles suffisantes pour obtenir le sérum, avec les propriétés suivantes:

- Mélangé avec des globules rouges de patients atteints de tumeurs malignes de l'agglutination des globules rouges dans un assez grand pourcentage de cas;

- Procédé selon l'une immunofluorescence indirecte a révélé une membrane spécifique (de périphérique) lueur des cellules tumorales malignes, quelle que soit la histogénèse avec la microscopie à fluorescence, ce qui démontre le tropisme universel (sensibilité), le sérum obtenu à des cellules tumorales et peut servir de base à la création d'un système de test pathologique.

L'essence d'un procédé de production de l'agent. Dans le système syngénique strictement effectué une immunisation à étapes multiples. Dans le cas le plus simple, il est possible de limiter essentiellement deux étapes. Le premier d'entre eux est fait dans l'introduction de cellules animales de manière significative syngéniques l'organisme de dérivés de femmes enceintes à un certain stade de la grossesse. Les cellules d'entrée que les cellules contenant les cellules appropriées et chorion embryon. Après la période de temps requise imunnogo les leucocytes des animaux sont collectés par tout moyen et introduit dans le corps d'un autre, avec l'animal syngénique précédent. Aux deux étapes de traitement doit être administré cellules antimitotiques, avec l'introduction des immunostimulants (adjuvants) ou sans substitution ou la fraction membranaire de cellules entières. Sérum (ou d'un composant immunitaire) sont extraites du dernier groupe d'animaux, après le temps nécessaire pour former un composant quantité suffisante de imunnogo dans le sang de l'animal après la deuxième étape de vaccination.

Tout système peut être utilisé des animaux syngéniques, en utilisant de préférence des souris.

idiotypique du sérum a été préparé comme suit.

1. Préparation de 12-day-old ligne embryonnaire de cellules de souris BALB (c) et la tenue de la première immunisation.

Le jour 12 femmes enceintes abattus traction de la colonne cervicale ou d'autres moyens disponibles. paroi abdominale antérieure a été traité avec 95% d'éthanol, est ouverte à travers la surface avant. Les deux cornes de l'utérus est séparé des vases communicants (mésentère est coupé), couper son utérus département vaginal et transféré à un excès d'une version froide de solution. L'utérus a été coupé à dlinniku, mâchoires séparées dans le tissu embryonnaire avec une solution tissus choriales. La solution en excès est éliminé Version Pasteur pipette, enlever les restes des reines. Embryonic sol chorion de tissu finement avec des ciseaux et beaucoup de nouvelle version fraîche de la solution est transférée à un agitateur magnétique dans des flacons stériles pendant 25-30 minutes. Après le temps indiqué, la suspension a été filtrée à travers une double gaze de filtre de couche, les cellules ont été lavées trois fois avec un excès de solution froide Hanks (à 1500 tr / min 3-4 min). La concentration des cellules vivantes comptées dans la solution dans la chambre Gorjacheva d'une manière connue. cellules pré culottées par centrifugation à 1500 tr / min, retirer l'excès de solution de Hanks, et le culot cellulaire pour faire GAF (GAF - adjuvant incomplet de Freud) à raison de 10 millions de cellules. - 0,1 ml d'IFA. Le mélange a été remis en suspension pour former une émulsion stable et administrée goutte à goutte au dos des animaux syngéniques débit de 0,1 ml par émulsion.

2. Réaliser la seconde immunisation.

14 jours après l'achèvement de la première étape d'animaux immunisés sont sacrifiés et le prétraitement est réalisé de façon analogue à la coupe ci-dessus. La rate est enlevée et les a transférés dans un mélangeur avec la version 4 ml de solution. L'homogénat a été filtré à travers un filtre à double couche de gaze, le mélange est lavé une fois dans une solution de Hank, et le mélange a été déposé en couche sur Ficoll-verografin (densité - 1077). Isolation des splénocytes (à savoir, les leucocytes produits à partir de la rate) produisant le gradient de densité à 2000 tr / min pendant 20-25 min (selon le volume initial de la suspension), et continuer jusqu'à un "anneau" clairement perceptible, situé à la frontière des solutions . Les splénocytes ( "ring") sont sélectionnés finement dessinés Pasterka, lavées une fois dans la solution de Hank, une suspension est irradiée. La dose de rayonnement était de 50 Gy (ie, 5000 rads). Produire le nombre de cellules et ajouté à trois des cellules lavées après l'irradiation de l'adjuvant incomplet de Freud, même base que dans la revendication 1. L'émulsion a été administré par voie intrapéritonéale à des animaux syngéniques d'un taux de 0,1 ml par un.

3. Préparation du sérum

12 jours après la dernière immunisation, du sang est prélevé dans le coeur sous des cavités anesthésie à l'éther. Le sang obtenu a été laissé au repos à température ambiante pour former un caillot dense, centrifugés à 1500 tr / min, pour toutes les 2-3 minutes sédimentation. Le sérum a été recueilli Pasterka finement étiré, on chauffe à 56 ° C pendant 15 minutes, pour adsorber excès homogénat des cellules du foie, des reins, de la rate de souris syngéniques BALB (s), centrifugés à 8-9000 tr / min pendant 20 minutes, filtre millipore filtré (0,22 um ).

4. sérum de test. Le sérum ainsi obtenu est contrôlé de cette manière dans le procédé de l'immunofluorescence indirecte sur coupes non fixées (6-10 microns) de toute souche de la tumeur (B-16, CC-2 et ainsi de suite.). Le sérum est considéré comme actif si la luminescence membranaire spécifique détecté des cellules tumorales dans une dilution finale de 1: 1.

Dans le cas particulier de la méthode de traitement est possible des agents antimitotiques de cellules administrées comme suit:

a) des cellules embryonnaires (y compris les cellules de chorion) laboratoire linéaire animal (par exemple, la souris) prendre un âge gestationnel conditionné gestation développement embryonnaire particulier et les caractéristiques d'un type spécifique de l'animal de laboratoire.

b) Les cellules spécifiées au point. (a), sont traitées par des agents connus antimitotiques (par exemple, la mitomycine C, le rayonnement gamma, ou autre).

c) les paramètres et le traitement des cellules de temps n. (b) sont suffisamment déterminés pour atteindre cesser leur activité mitotique et / ou le métabolisme.

d) traité par n. (c) Les cellules sont injectées dans le corps avec ces cellules syngéniques des animaux de laboratoire à immunostimulants connus sont utilisés dans des techniques immunologiques (par exemple, l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund, etc.). La voie d'administration est déterminée par les paramètres du produit cuit.

e) La quantité de immunostimulant est déterminé par le nombre de cellules et une sorte d'un animal de laboratoire et est considéré comme l'optimum dans chaque cas, lorsque son utilisation augmente la concentration d'immunoglobulines dans le sang d'un animal immunisé pendant un temps plus court que sans l'application ou fournit une plus grande concentration sur en même temps que sans son utilisation.

f) provenant d'animaux traités selon les revendications. (d, e), les globules blancs sont récupérés par tout moyen connu après un certain laps de temps.

g) La période de réclamation. (f) est considérée comme suffisante si la concentration d'immunoglobulines dans le sang d'un animal immunitaire atteint des valeurs optimales. La concentration optimale des immunoglobulines doit être envisagée si son taux d'augmentation dans le sang d'un animal immunitaire commence à décliner.

h) Les leucocytes obtenus à partir de n. (f, g), un agent antimitotique traité de manière similaire N °. (b, c).

i) Après le traitement selon la revendication leucocytes. (h) pour produire leurs immunostimulants d'introduction (comme dans pp.d, e) dans le corps avec leucocytes des animaux syngéniques en quantité et en volume pour le titre optimal optimal des anticorps anti-idiotypiques.

j) le titre d'anticorps anti-idiotype est considéré comme optimal si idiotypes peut détecter les antigènes foetaux stade sur des cellules tumorales dans les méthodes d'essai connues.

k) Après avoir atteint la concentration des anticorps anti-idiotypiques dans le sang des animaux de laboratoire traités selon la revendication. (I) selon la revendication suffisante. (j), produire le composant de sélection immunitaire dont la composition décrite ci-dessus.

Procédé de réalisation est un procédé caractérisé en ce que n. (D i), dans lequel les cellules entières sont remplacées par une fraction biologiquement active (par exemple, des membranes ou leur etc.). Le remplacement est considérée comme adéquate si elle conduit au résultat pour n. J).

Antiembrionalnaya sérum idiotypique a été testé avec le PO de mise en oeuvre d'essai (TURTEST) - Méthode de détection biochimique immunologique des antigènes de cellules malignes dans le sang du patient en se basant sur la capacité à agglutiner des globules rouges en interaction avec ce sérum. L'intensité de la réaction quantifiée par une variation de la vitesse de sédimentation érythrocytaire en interaction avec le sérum antiembrionalnoy anti-idiotypique par rapport à leur décantation par l'interaction avec le sérum témoin. Malignant facteur de croissance cellulaire (K sp) est déterminée comme suit: la valeur moyenne obtenue par les deux échantillons de contrôle et de l' échantillon avec un anticorps anti-idiotype de travail antiembrionalnoy sérum divisé par la valeur multipliée par 50, et une grande quantité de 3 sondes. Si le résultat est supérieur à 1,5, il indique la présence d'une tumeur maligne dans le corps du patient.

L'efficacité de ce sérum pour le diagnostic de tumeurs malignes est illustrée par les exemples suivants.

exemple 1

Un patient atteint d'une tumeur dans l'oreillette gauche a été soumis à l'étude à l'essai PO. Il était de 2,3 sp. Ce fut la cause de l'hypothèse de la présence de tumeurs malignes. Après la chirurgie, l'histologie a confirmé la malignité - fibromiksosarkomu oreillette gauche.

exemple 2

Le patient S. tumeur maligne du péricarde (mésothéliome malin) a été découvert après une biopsie. Après le test PO facteur de croissance maligne K sp a été de 2,8, qui a confirmé le diagnostic initial de cancer.

exemple 3 :

Quatre patients avec myxome auriculaire essai droit RO a été réalisée avant la chirurgie; K sp 0,8. Après la chirurgie, l'histologie a confirmé les tumeurs bénignes.

exemple 4

Trois enfants avec Rhabdomyome dans le bon test coeur-RO a été réalisée avant l'intervention chirurgicale. K sp 0,9; 0,96 et 1,1 respectivement. Suite à l'histologie des opérations a confirmé la présence nemiksomatoznyh tumeur bénigne de coeur - rhabdome.

L'étude a été menée sur plus de 10.000 patients dans différents hôpitaux de la Fédération de Russie. En particulier, des études menées en NC MHS eux. Bakulev RAMS et NFM 9 ministère de la Santé, a montré les résultats suivants (voir. Table). Le tableau montre que la sensibilité de la méthode est très élevée, atteignant presque 100%, ce qui confirme la valeur diagnostique de sérum obtenu par le procédé selon l'invention.

idiotypique du sérum obtenu par la méthode proposée est efficace dans le diagnostic des tumeurs de différentes localisations et à tout stade de développement du cancer.

REVENDICATIONS

1. Un procédé pour la production de sérums anti-idiotype pour le diagnostic des tumeurs malignes, comprenant que, dans le système syngénique dans la première phase produisent de manière significative l'administration à un cellules foetales syngéniques animales à partir du tissu chorionique correspondant à la souris de 12,7 jours tissus embryonnaires provenant d'animaux gravides le même système syngénique, la deuxième phase après 5-14 jours après l'entrée des cellules embryonnaires prélevées sur un leucocytes des animaux immunisés et les introduire dans le corps d'un syngénique des animaux avec la précédente, et après 4-12 jours après la dernière immunisation, le sérum a été préparé par échantillonnage du sang de l'animal Il ne reste plus à la température ambiante pour former un caillot dense, puis centrifugée érythrocytaire complète du sérum dérivé collecté, chauffé à 60 ° C pour adsorber l' homogénat cellulaire en excès des animaux syngéniques , suivie par une centrifugation et la filtration.

2. Procédé selon la revendication. 1, caractérisée en ce que les deux étages d'entrée des cellules traitées antimitotiques, ou injecté avec les immunostimulants, ou remplacer toute la fraction membranaire de cellules.

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Date de publication 02.04.2007gg