special

This webpage has been robot translated, sorry for typos if any. To view the original content of the page, simply replace the translation subdomain with www in the address bar or use this link.


ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2251701

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИЙ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИЙ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

Имя изобретателя: Сизякина Людмила Петровна (RU); Андреева Ирина Ивановна (RU) 
Имя патентообладателя: Сизякина Людмила Петровна (RU); Андреева Ирина Ивановна (RU)
Адрес для переписки: 344022, г.Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29, Ростовский государственный медицинский университет, патентный отдел
Дата начала действия патента: 2004.06.07 

Изобретение относится к области клинической иммунологии и может быть использовано для определения стадий ВИЧ-инфекции. Сущность изобретения состоит в том, что методом иммуноферментного анализа тестируют сыворотку крови, определяют оптическую плотность - ОП исходного образца сыворотки и оптическую плотность исходного образца сыворотки, инкубированного в течение 10 минут со 100 мкл 3,5 М раствора изотиоционата натрия - NaSCN и при снижении ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении ОП в интервале 40-60% диагностируют стадию В - пре-СПИД, а при снижении ОП на 60% и более диагностируют стадию С - СПИД.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины, преимущественно клинической иммунологии, а именно к иммунодиагностике инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), и может найти применение при определении стадий ВИЧ-инфекции.

ВИЧ-инфекция продолжает оставаться одной из самых актуальных проблем современной медицины. С 1990 года регистрируется пандемия, что означает распространение этой болезни по всей планете, при этом в России за последние 3 года зарегистрировано свыше 200 тысяч инфицированных ВИЧ. Распространяясь на “новые” территории, болезнь не уходит из захваченных ранее. Кроме того, биология ВИЧ-инфекции такова, что отсутствуют естественные механизмы противостояния, и только социальные факторы способны противодействовать дальнейшей прогрессии пандемии (P.M.Хаитов, Г.А.Игнатьева, И.Г.Сидорович. Иммунология - М.: Медицина, 2000. - С.291-295).

К реально эффективным средствам борьбы с распространением ВИЧ следует отнести своевременную и качественную диагностику, значимость которой прослеживается с двух позиций. Во-первых, выявление факта инфицирования позволяет использовать действенные способы профилактики дальнейшего распространения инфекции. Во-вторых, ранняя диагностика при инфицировании ВИЧ способствует своевременному назначению достаточно эффективных терапевтических мероприятий, которые пролонгируют начальные стадии ВИЧ-инфекции и таким образом существенно влияют на ее прогрессию. В этой связи весьма актуальной продолжает оставаться проблема выбора надежных критериев, позволяющих быстро, достоверно, своевременно и с наименьшими материальными затратами определить стадии инфекционного процесса, вызванного ВИЧ (Л.П.Сизякина, В.Н.Чернышев - ВИЧ-инфекция у детей. - Ростов-на-Дону, - 2001. - С.81).

В настоящее время ВОЗ принята классификация стадий инфекционного процесса, опосредованного ВИЧ, основанная на клинических проявлениях, в соответствии с которыми определяют начальную или стадию А - генерализованной лимфаденопатии (ГЛАП), для которой характерно не только отсутствие патогномоничных признаков, но и клинически стабильное состояние пациента. Стадия В (пре-СПИД) характеризуется нарастанием разнообразной клинически значимой симптоматики - бациллярный ангиоматоз, орофарингиальный кандидоз, цервикальная карцинома, общеинфекционные синдромы, такие как лихорадка или диарея более месяца, лейкоплакия языка, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, периферическая нейропатия. Для стадии С - СПИД (терминальной) характерными клиническими признаками являются легочный туберкулез, рецидивирующая пневмония, опухоли разнообразной локализации (CDC MMWR, 1992, v.41, N RR - 17, р.22). Определение стадий инфекционного процесса необходимо для обоснования варианта своевременной адекватной терапии, позволяющей удлинить средние сроки жизни инфицированных ВИЧ и для профилактики распространения инфекции. Проведенный анализ патентной и научно-медицинской литературы выявил ряд способов диагностики стадий ВИЧ-инфекции.

В частности, тестом, используемым при определении стадий ВИЧ-инфекции и служащим основанием для назначения противовирусной терапии является оценка вирусной нагрузки периферической крови посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Кравченко А.В., Серебровская Л.В., Голохвостова Е.Л. и др. Тимазид в сочетании с хивидом и инвиразой в комплесной терапии больных с ВИЧ-ифекцией. - Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1998. - №5 - с.51-52). Сущность метода заключается в количественном определении копий РНК вируса в плазме. Однако следует отметить отсутствие четкой корреляции между прогрессией инфекционного процесса и вирусной нагрузкой плазмы. В частности, стадии А ВИЧ-инфекции соответствует высокий уровень содержания вируса в плазме. Следующая стадия - В (пре-СПИД) характеризуется существенным снижением числа копий РНК вируса, несмотря на клиническую прогрессию инфекции. В терминальной стадии С (СПИД) вновь регистрируется неограниченная прогрессия уровня РНК ВИЧ в крови (В.В.Шкарин, С.Н.Соринсон. ВИЧ/СПИД - инфекция. Двадцать лет спустя после начала пандемии. - Н.-Новгород: Изд-во НГМА, 1999. - С.43). Таким образом, данный тест недостаточно информативен для характеристики уровня развивающегося иммунодефицита. К недостаткам метода следует отнести и его высокие технологическую сложность и стоимость, а именно: необходимость строгого соблюдения особых условий - стерильности и температурного режима при заборе крови, ее транспортировке и проведении теста. При этом помимо сертифицированных диагностических наборов необходимы не только весьма дорогостоящие приборы, но и комплекс лабораторных комнат, в том числе стерильных боксов. Непосредственная методика определения генома вируса достаточно трудоемка и длительна, занимает не менее 5 часов.

Способ лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции (патент №2123187 опубликован в БИ №34) предусматривает ионнообменную хромотографию сыворотки с последующим ИФА определением уровня “скрытых” антител. Данный метод, имеющий значение в прогнозе течения ВИЧ-инфекции, не ориентирован на определение ее стадий.

Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека (пат. №2032907 опубликован в БИ №10) может быть использован при установлении факта инфицирования ВИЧ, но не связан с определением стадии инфекции.

Способ твердофазного иммуноферментного определения антител к вирусу иммунодефицита человека (пат. 4653296/30-13, БИ №45) имеет целью повышение чувствительности способа определения антител к ВИЧ, но и не может быть использован для диагностики стадии инфекционного процесса.

Известен способ оценки стадий ВИЧ-инфекции (Клиническая иммунология и аллергология под ред. Г.Лолора-младшего. - М., Практика, 2000. – С. 585-587), заключающийся в определении уровня сывороточного 2-микроглобулина. Увеличение концентрации этого белка, определяемого с помощью диагностических наборов иммуноферментного анализа, соответствует прогрессии ВИЧ-инфекции. Между тем, данные изменения неспецифичны, поскольку подобная динамика 2-микроглобулина возможна не только при ВИЧ-инфекции, но и при опухолевых процессах, циррозе печени, лимфопролиферативных заболеваниях. Таким образом, этот метод недостаточно информативен для оценки стадий ВИЧ-инфекции ввиду своей неспецифичности (А.Ройт, Дж. Бристофф Иммунология. - М.: Мир, 2000. - с.411).

Наиболее близким техническим решением, принятым нами за прототип, является способ диагностики стадий ВИЧ-инфекции (В.В.Покровский с соавт. “Клиническая диагностика и лечение ВИЧ-инфекции”. - М.: ГОУ ВУНМЦ РФ, 2001. - С.11), заключающийся в определении абсолютного количества CD4+ лимфоцитов периферической крови. Данная методика состоит из ряда последовательных этапов: выделения популяции лимфоцитов посредством наслоения 2 миллилитров крови на заранее приготовленный раствор фиколла и верографина с градиентом плотности 1,077 г/см3, центрифугирования полученной смеси на центрифуге ОПН-3 при скорости 1 тыс. оборотов в минуту в течение 35 минут, удаления в отдельную пробирку образовавшегося “лимфоцитарного кольца” с последующей трехкратной “отмывкой” от смеси фиколл - верографин центрифугированием в культуральной среде 199 при 1,5 тыс. оборотов в минуту в течение 5 минут. Далее к отмытой взвеси лимфоцитов добавляют моноклональные антитела к CD4 поверхностному антигену, меченные флюорохромом, полученную взвесь инкубируют в течение 40 минут при 4°С, после чего вновь отмывают на центрифуге ОПН-3 в среде 199 в течение 5 минут при 1,5 тысячах оборотов в минуту. После этого проводят определение относительного количества CD4 позитивных лимфоцитов на проточном цитофлюориметре. Именно этот прибор дает возможность наиболее адекватной оценки уровня CD4+ клеток. В тот же день определяют формулу крови пациента, после чего рассчитывают абсолютное количество CD4+лифoцитoв по формуле: число лейкоцитов ×109л×% лимфоцитов×%CD4+лимфoцитoв:10000. При этом, если абсолютное число CD4+ Т-клеток более 0,5×109/л, диагностируют стадию А; при абсолютном количестве CD4+лифoцитoв в пределах 0,2-0,499×109 /л - стадию В; при абсолютном числе CD4+ лимфоцитов менее 0,2 клеток ×109/л диагностируют стадию С - (CDC MMWR, 1992, v.41, N RR - 17, р.22). Недостаток способа - сложность его реализации. В частности, результаты данного теста могут быть объективными лишь при использовании высокоспецифичных сертифицированных реактивов (моноклональных антител) и крайне дорогостоящего прибора - проточного цитофлюориметра, требующего вспомогательного обслуживающего персонала - инженеров, программистов. Эти диагностические приборы находятся лишь в специализированных центрах регионального масштаба, что значительно усложняет возможность оценки стадий ВИЧ-инфекции. В первую очередь из-за того, что анализ основан на характеристике рецепторов жизнеспособных клеток крови, поэтому исследование ограничено временными рамками - интервал между забором крови и ее тестированием не должен превышать 3-4 часов. Методику усложняют и дополнительные анализы - определение формулы крови и общего числа лейкоцитов с целью подсчета основного критерия - абсолютного числа CD4+ лимфоцитов периферической крови. Для прототипа характерна недостаточная информативность из-за лабильности показателей, не связанной непосредственно с фактом инфицирования ВИЧ. Изменения числа CD4+ лимфоцитов весьма неспецифичны и могут наблюдаться при других заболеваниях. В этой связи диагностическая значимость теста может быть важна лишь в контексте с другими критериями ВИЧ-инфекции.

Целью настоящего изобретения является упрощение способа диагностики стадий ВИЧ-инфекции.

Эта цель достигается путем исследования сыворотки крови пациента, которую делят на 2 порции. На основе иммуноферментного анализа определяют оптическую плотность (ОП) исходного образца сыворотки, отражающую уровень специфических анти-ВИЧ антител у пациента и ОП второй порции, инкубированной в течение 10 мин со 100 мкл 3,5 М раствора изотиоционата натрия и характеризующей уровень анти-ВИЧ-иммуноглобулинов, не разрушивших связь с антигенами ИФА-планшета в условиях инкубации с NaSCN. На основании полученных результатов по % снижения значений ОП исходной сыворотки определяют стадию ВИЧ-инфекции: при снижении ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении оптической плотности в открытом интервале 40-60% диагностируют стадию В - пре-СПИД, а при снижении ОП на 60% и более диагностируют стадию С - СПИД.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: у пациента проводят забор венозной крови в количестве 2-3 миллилитров, после чего ее центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 минут на центрифуге ОПН-3, отделяют сыворотку крови, делят ее на 2 порции. Образец сыворотки добавляют в лунку диагностической ИФА тест-системы с сорбированными антигенами ВИЧ (в соответствии с приказом МЗ и МП РФ №170 от 16.08.94). Затем отмывают раствор с целью удаления компонентов сыворотки, не связавшихся с ВИЧ-антигенами. Далее в лунку добавляют антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с ферментом, меняющим окраску последовательно добавленного химического реагента - субстрата. При этом в случае наличия в тестируемой сыворотке анти-ВИЧ-антител содержимое лунки изменяет цвет. С использованием специального прибора - иммуноферментного автоматического анализатора определяют оптическую плотность содержимого лунки, отражающую уровень специфических антител к ВИЧ в исследуемом образце.

Одновременно во вторую лунку диагностического планшета помимо тестируемой сыворотки добавляют 100 мкл 3,5 М раствора изотиоционата натрия (NaSCN ), полученный раствор инкубируют в течение 10 мин. Далее соблюдается последовательность этапов, описанная выше: отмывают раствор с целью удаления компонентов сыворотки, не связавшихся с ВИЧ-антигенами, в лунку добавляют антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с ферментом, меняющим окраску последовательно добавленного химического реагента - субстрата, при наличии в тестируемой сыворотке анти-ВИЧ-антител содержимое лунки меняет цвет. С использованием иммуноферментного автоматического анализатора определяют оптическую плотность содержимого лунки, отражающую уровень специфических антител к ВИЧ после обработки 3,5 М раствором изотиоционата натрия (NaSCN).

Далее вычисляют% изменения ОП по отношению к исходному образцу сыворотки и при снижении значений ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении ОП в открытом интервале 40-60% диагностируют стадию В - пре-СПИД, а при снижении ОП на 60% и более диагностируют стадию С - СПИД.

Реализуемость способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Пациент С., история болезни №122/198. При проведении эпидемиологического расследования был выявлен как контактный с инфицированным ВИЧ. При клиническом осмотре признаков патологии не выявлено. Жалоб не было, состояние удовлетворительное. Пациенту, согласно предлагаемому способу было проведено исследование сыворотки крови, в результате которого получены следующие результаты: ОП исх=1500, ОП инк=1200. В связи со снижением ОП на 20% диагностирована стадия А ВИЧ-инфекции.

Пример 2. Пациент Д., история болезни 68/103. При плановом диспансерном обследовании была выявлена генерализованная лимфаденопатия, гепатосплеиомегалия. Пациенту в соответствии с заявляемым способом было проведено исследование сыворотки крови. Значение ОП исх=1627, ОП инк=897, снижение значения ОП=45%, в связи с чем больному поставлен диагноз: ВИЧ-инфекция, стадия В - пре-СПИД, назначена адекватная терапия.

Пример 3. Пациент Е., история болезни 1203/109. Находился в инфекционном стационаре с клиническими проявлениями пневмоцистной пневмонии и нефропатии. Больному в соответствии с заявляемым способом было проведено исследование сыворотки крови. ОП исх=1020, ОП инк=340, снижение оптической плотности = 67%. Больному в соответствии с заявляемым способом был поставлен диагноз “СПИД”, назначена адекватная терапия.

Пример 4. Пациент С., история болезни 101/04. В течение года состоял на диспансерном учете в областном центре по профилактике и борьбе со СПИДом, жалоб не предъявлял. В соответствии с заявляемым способом было проведено исследование сыворотки крови. Значение ОП исх=1920, ОП инк=1152, снижение ОП=40%, в связи с чем поставлен диагноз: ВИЧ-инфекция, стадия А - генерализованная лимфаденопатия.

Пример 5. Пациент Ш., история болезни 88/98. Выявлен как контактный с инфикцированными ВИЧ внутривенными наркоманами. При клиническом осмотре была выявлена пневмония, установлен факт снижения массы тела на 16 кг в течение полугода. Пациенту в соответствии с заявляемым способом было проведено исследование сыворотки крови. Значение ОП исх=1950, ОП инк=780, снижение значения ОП=60%. Больному был поставлен диагноз - ВИЧ-инфекция, стадия С - “СПИД”, назначена адекватная терапия.

В соответствии с предлагаемым способом оценки стадий ВИЧ-инфекции нами на базе НУПК “Клиническая иммунология” РостГМУ были протестированы 86 образцов сывороток инфицированных пациентов. Из них 44 поставлен диагноз: ВИЧ-инфекция в стадии А, так как снижение значений ОП составило 40 и менее %, 32 пациентам - диагноз: ВИЧ-инфекция в стадии В - пре-СПИД (ОП снижалась более, чем на 40, но менее, чем на 60%), а у 10 человек диагностирована стадия С (СПИД), при этом % снижения ОП был 60 и более.

Нами был проведен анализ 42 историй болезни лиц, находящихся на стационарном лечении в специализированном отделении ВИЧ-инфекции ГБ-1 г. Ростова-на-Дону, Из них у 20 человек был диагноз “ВИЧ-инфекция в стадии А (ГЛАП)”, у 16 - “ВИЧ-инфекция в стадии В (пре-СПИД)”, а у 6 - “СПИД”. Этим пациентам нами были проведены исследования согласно заявляемому способу. Полученные результаты показали, что у 3 человек из 20 диагноз “ВИЧ-инфекция в стадии А” был поставлен ошибочно, нами у данных пациентов была диагностирована стадия В - пре-СПИД (ОП снижалась более, чем на 40, но менее, чем на 60%), что в последствии подтвердилось клиническими признаками, 4 пациентам из 16 с диагнозом стадия В (пре-СПИД) нами на основе заявляемого способа диагностики стадий ВИЧ-инфекции был определен диагноз “СПИД”, так как % снижения ОП=60 и более. Это позволило своевременно откорректировать проводимую терапию. В 100% случаев терминальной стадии ВИЧ-инфекции С (СПИД) диагнозы совпадали (у всех пациентов снижение ОП было равным или превышало 60%). При этом для диагностики стадий ВИЧ-инфекции в соответствии с заявляемым способом не требовалось использования дополнительных трудозатрат, диагностических наборов и дорогостоящего оборудования.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с прототипом более прост.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ диагностики стадий ВИЧ-инфекции путем исследования крови, отличающийся тем, что тестируют сыворотку крови методом иммуноферментного анализа, определяют оптическую плотность - ОП исходного образца сыворотки и оптическую плотность исходного образца сыворотки, инкубированного в течение 10 мин со 100 мкл 3,5 М раствора изотиоционата натрия - NaSCN и при снижении ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении ОП в интервале 40-60% диагностируют стадию В - пре-СПИД, а при снижении ОП на 60% и более диагностируют стадию С - СПИД.

Версия для печати
Дата публикации 06.01.2007гг


НОВЫЕ СТАТЬИ И ПУБЛИКАЦИИ НОВЫЕ СТАТЬИ И ПУБЛИКАЦИИ НОВЫЕ СТАТЬИ И ПУБЛИКАЦИИ

Технология изготовления универсальных муфт для бесварочного, безрезьбового, бесфлянцевого соединения отрезков труб в трубопроводах высокого давления (имеется видео)
Технология очистки нефти и нефтепродуктов
О возможности перемещения замкнутой механической системы за счёт внутренних сил
Свечение жидкости в тонких диэлектрических каналох
Взаимосвязь между квантовой и классической механикой
Миллиметровые волны в медицине. Новый взгляд. ММВ терапия
Магнитный двигатель
Источник тепла на базе нососных агрегатов


Created/Updated: 25.05.2018

';>